Спектральные методы

Все спектральные методы, применяемые в химическом анализе почв, основаны на взаимодействии различных типов электромагнитного излучения (инфракрасного, видимого, ультрафиолетового, рентгеновского) с анализируемой пробой и на регистрации изменений, произошедших с потоком этого излучения после взаимодействия с анализируемым веществом. Спектральные методы, используемые в химическом анализе почв, делятся на две большие группы: молекулярную и атомную спектрофотометрню. Методы атомной спектрофотометрии, в свою очередь, делятся на методы эмиссионной и абсорбционной спектрофотометрии. (РУКОВОДСТВО К БОЛЬШОМУ ПРАКТИКУМУ «СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ПОЧВ», Екатеринбург, 2008)

Методы молекулярной спектрофотометрии

Теоретические основы взаимодействия света с анализируемым веществом рассмотрим на примере молекулярной спектрофотометрии. Из основ квантовой механики известно, что электромагнитное излучение, будь то радиоволны, инфракрасное, видимое или ультрафиолетовое излучение или гамма-лучи, имеет дуалистическую природу и представляет собой поток частиц, называемых квантами, энергия которых определяется длиной волны или частотой данного излучения. Взаимосвязь частоты излучения и энергии его кванта описывается уравнением Планка: E=hv,

где: Е-энергия, Дж; h -постоянная Планка (6,38-10" Дж-с), v- частота колебаний, Гц.

В соответствии с принципами термодинамики, электроны в атоме стремятся обладать минимумом энергии и в спокойном состоянии при отсутствии внешних воздействий находятся на самых низких энергетических уровнях. Такое энергетическое состояние называется основным. При поглощении кванта электромагнитного излучения соответствующей частоты электрон переходит (или «забрасывается») на более высокие энергетические уровни. Такое состояние электрона называют возбужденным. Следует отметить, что при таком переходе соблюдается квантово-механический принцип, вытекающий из дуалистической корпуску- лярно-волновой природы электромагнитных волн. Он заключается в том, что энергия кванта должна удовлетворять соотношению:

Соответственно, переход электрона из возбужденного состояния в основное сопровождается испусканием кванта определенной энергии. Электронные спектры атомов являются линейчатыми (т.е. состоят из линий поглощения очень малой ширины) и располагаются обычно в ультрафиолетовой и видимой области спектра электромагнитных волн. На этом явлении основаны почти все применяемые в почвенном анализе фотометрические методы, которые имеют два очень важных преимущества в изучении качественных и количественных характеристик исследуемых компонентов почв по сравнению с классическими химическими методами количественного анализа.

Во-первых, вследствие линейчатости атомных спектров достигается высокая селективность, благодаря которой появляется возможность не только качественного, но и количественного определения веществ в весьма сложных многокомпонентных системах, с которыми исследователь особенно часто сталкивается при анализе почв. Во-вторых, фотометрические методы обладают высокой чувствительностью и позволяют определять некоторые вещества при их концентрации в исследуемом растворе до 1.

Возможность количественного определения анализируемого вещества спек- трофотометрическим методом основана на законе Бугера-Ламберта-Бэра, описывающего линейную зависимость между поглощением электромагнитного излучения A (absorbance) и концентрацией вещества с, вызвавшего это поглощение при длине волны электромагнитного излучения.

Из методов молекулярной спектрофотометрии в химическом анализе почв наиболее часто используются методы молекулярной абсорбционной спектроскопии в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Объектом спек- трофотометрических измерений, как правило, являются растворы. Фотометрируемый раствор помещают в кювету - сосуд с плоскими параллельными прозрачными гранями.

Метод молекулярной абсорбционной спектрофотометрии основан на оценке изменений интенсивности светового потока, проходящего через раствор, содержащий анализируемое вещество. Главные достоинства спектрофотометрии - простота использования, несложное оборудование. Чувствительность и селективность метода можно значительно увеличить в ходе подготовки проб к анализу, отделяя мешающие компоненты и переводя определяемое вещество в форму, обладающую как можно большей величиной молярного коэффициента поглощения. К чувствительным фотометрическим методам относят те методы, которым соответствует молярный коэффициент поглощения, равный или больший 10 . Фотометрические методы количественного анализа обладают меньшим пределом обнаружения, чем классические химические методы - гравиметрические и титр и метр и чес кие. Это позволяет использовать фотометрию не только для определения макроэлементов, но и для определения элементов, которые присутствуют в почвах в микроколичествах.

В фотометрическом анализе центральное место занимает химическая реакция, с помощью которой химический элемент переводят в форму окрашенного соединения. Время, затрачиваемое на анализ, и другие характеристики метода (чувствительность, точность, избирательность) зависят от выбора химической реакции и условий ее осуществления.

Способность поглощать свет связана с электронным строением атомов или молекул. В фотометрии используют два типа поглощающих свет соединений: соединения, у которых хромофорными свойствами обладает ион определяемого элемента, и соединения, хромофорные свойства которых связаны с реагентом (лигандом).

Порядок работы па спектрофотометре или фотоколориметре.

Все регулировочные работы, связанные с проникновением в корпус приборов к то- коведущим частям, замена неисправных деталей, разъединение и подключение штепсельных разъемов должны проводиться после отсоединения колориметра от сети. После включения прибора в сеть устанавливают длину волны, необходимую для данного анализа, соответствующую максимальному светопоглощению фотометрируемого раствора.

При работе на фотоколориметре устанавливают соответствующий светофильтр, при работе на спектрофотометре регулируют положение дифракционной решетки. В кю- ветную камеру помещают кювету с чистым растворителем (дистиллированной водой). Устанавливают стрелку индикаторного миллиамперметра на 0 оптической плотности. Затем приступают к регулировке усиления сигнала. Для этого устанавливают в кювет- ную камеру стандартный раствор с наибольшей концентрацией определяемого компонента и измеряют его оптическую плотность. Регулируя усиление, устанавливают стрелку индикаторного прибора на уровень 80-90% светопоглощения. После этого еще раз измеряют оптическую плотность чистого растворителя и корректируют нулевую точку. Абсолютная погрешность измерения све- топропускания не превышает 1%.

Относительная погрешность измерения оптической плотности раствора достигает минимума при значении оптической плотности 0,4. Поэтому при работе на колориметре или спектрофотометре рекомендуется путем соответствующего выбора кювет проводить измерения вблизи указанного значения оптической плотности. Предварительный выбор кювет проводится визуально, соответственно интенсивности окраски раствора. Если раствор интенсивно окрашен (темный), следует пользоваться кюветами с малой длиной оптического пути (1-3 мм). В случае слабо окрашенных растворов рекомендуется работать с кюветами с большой рабочей длиной (30-100 мм). В предварительно подобранную кювету наливают раствор и измеряют его оптическую плотность, установив соответствующий для данного раствора светофильтр. При работе с рядом растворов кювету заполнить раствором средней концентрации. Если полученное значение оптической плотности составляет примерно 0,3-0,5, использовать данную кювету для работы с этим раствором. Если величина измеренной оптической плотности больше 0,5-0,6, берут кювету меньшей оптической длины, если величина оптической плотности меньше 0,3-0,2, следует выбирать кювету с большей оптической длиной.

После выполнения всех настроек и подбора оптимальных условий анализа производят определение оптической плотности серии стандартных растворов, начиная от раствора с наименьшей концентрацией определяемого компонента. После этого производят измерение оптической плотности анализируемых проб, перед каждым измерением промывая кювету сначала дистиллированной водой, а затем анализируемым раствором.

Работа на спектрофотометрах различных марок и моделей незначительно отличается друг от друга. В простых приборах установка длины волны осуществляется с помощью смены светофильтра. При работе на спектрофотометре с проточной кюветой упрощается процедура смены анализируемых растворов, и вследствие этого скорость анализа увеличивается. В современных приборах установка длины волны и усиления сигнала может осуществляться автоматически, а индикация результатов анализа производится в единицах концентрации после проведения процедуры калибровки прибора.

При обращении с кюветами необходимо соблюдать ряд правил. Прежде всего, нельзя касаться пальцами рабочих участков поверхностей, перпендикулярных световому потоку стенок кюветы. Наличие загрязнений или капель раствора на рабочих поверхностях кюветы приводит к искажению результатов измерений. В случае загрязнения рабочие поверхности кювет перед измерением рекомендуется протирать спирто-эфирной смесью.

Исследуемые растворы наливаются в кюветы до или выше уровня метки на боковой стенке. Жидкость в ограниченном объеме кюветы в некоторых случаях образует мениск. По углам кювет с малой толщиной поглощающего слоя жидкость поднимается на значительную высоту, равную 4-6 мм. Если уровень жидкости превышает метку на боковой стенке кюветы, то может наблюдаться поднятие жидкости по углам, что создает впечатление протекания кюветы. Установку кювет в кюветодержатель необходимо производить с максимальной осторожностью, не наклоняя кювету с жидкостью. Поскольку кюветы заполняют не всю длину канавки кюветодержателя, следует устанавливать их друг напротив друга (можно вплотную к одному из краев канавки). Желательно закрывать кюветы стеклянными крышками, входящими в комплект прибора. При слабой окраске растворов используют более длиные кюветы, чтобы световой поток проходил через толстый слой окрашенной жидкости, при интенсивной окраске- короткие. После измерения кюветы тщательно промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой, переворачивают и ставят на фильтровальную бумагу, накрыв от пыли стеклянным колпаком. Высохшие кюветы помещают в футляр, входящий в комплект прибора.

После смены светофильтра, а также в случае нахождения колориметра при открытой крышке кюветного отделения длительное время (более 5 мин) измерения начинают после пятиминутной выдержки фотоприемника в освещенном состоянии, т.е. при закрытой крышке кюветного отделения работающего колориметра.

Спектрофотометрическое определение содержания углерода в почве

Метод объемного определения гумуса по Тюрину, наиболее часто применяемый в массовых анализах, дает достаточно точные результаты при значительной простоте и скорости определения. Введение вместо титрования фотометрического окончания по методу Цыпленкова [Патент ..., 1977] позволяет еще более упростить ход анализа благодаря тому, что отпадает необходимость приготовления титрованных растворов вообще, а титрование заменяется на измерение оптической плотности фотоэлектроколориметром или спектрофотометром.

Предложен ряд вариантов колориметрического и фотометрического определения гумуса. Эти методы отличаются деталями исполнения. Большинство авторов прибегают к разбавлению и отстаиванию суспензии после сжигания гумуса с последующим фотометрированием в красной области спектра. Окислителем обычно служит раствор бихромата калия в серной кислоте, но при разных соотношениях. Поскольку в растворах серной кислоты образуются ионы три- и тетрахромата, а при разбавлении раствора происходит их деполимеризация и окраска со временем (через 2–4 ч) становится более устойчивой, то фотометрирование рекомендуется проводить через несколько часов после разбавления, что обеспечивает как оседание суспензии, так и постоянство окраски. Некоторые авторы рекомендуют добавлять сухую соль K2Сr2O7 для обеспечения полноты окисления гумуса. Упомянутые методы мало различаются, варьируя по количеству и концентрации окислителя, условиям кипячения (нагревания), конечному объему раствора и способу измерения окраски.

Все определение складывается из двух основных операций: окисления гумуса и фотометрирования (колориметрирования) окрасок. Окисление гумуса целесообразно осуществлять по методу Тюрина. Это обеспечивает сопоставимость результатов, получаемых объемным и фотометрическим методом. В то же время количество бихромата, пошедшее на окисление, можно определять любым способом, не нарушая преемственности данных. Обязательным условием при подготовке растворов к фотометрированию должно быть их разбавление. Общим недостатком упомянутых выше методов является необходимость приготовления шкалы. Это удлиняет определение и снижает те преимущества, которые дает фотометрическое окончание. Малопригодны также колориметрические варианты по визуальной шкале. Все это приводит к выводу, что наиболее быстрым, экономичным и точным методом должен быть метод Тюрина со спектрофотометрическим окончанием, обязательно включающий разбавление фотометрируемых растворов. Расчет концентрации в этом случае ведется по формуле закона Бугера – Лам-берта – Бэра с заранее установленными коэффициентами погашения света. Указанным требованиям отвечает методика, предложенная Д. С. Орловым и Н. М. Гриндель [1967].

Обоснование спектрофотометрического метода

При окислении гумуса бихроматом шестивалентный хром восстанавливается до трехвалентного.В методе Тюрина учитывается количество бихромата, пошедшего на окисление гумуса, а при расчетах принимают эквивалентный вес углерода в этой реакции, равный 3, считая с некоторым приближением, что в гумусе атомное отношение Н:О = 2:1. Фотометрическое окончание метода не меняет, конечно, этих основных условий. Окраска чистого раствора бихромата калия варьирует от желтой (в разбавленных растворах) до оранжевой. В пределах видимой части спектра раствор бихромата имеет только один четко очерченный максимум при λ = 447 нм . По мере увеличения длины волны после максимума при 447 нм оптическая плотность падает, достигая нулевого значения около 570–580 нм. В красном участке видимой части спектра (580–720 нм) раствор бихромата практически не поглощает свет. В то же время спектр поглощения восстановленного хрома резко отличается от раствора бихромата калия – его максимум приходится на область 584–594 нм, имея среднее значение при 588–590 нм. Различия в коэффициентах погашения (ελ) для окисленной и восстановленной форм очень велики. В области максимума коэффициент погашения бихромата (рассчитанный на концентрацию, равную 1 мг-экв в 100 мл) равен 0,66, тогда как коэффициент погашения восстановленного хрома при той же длине волны всего лишь 0,062, т. е. меньше почти в 11 раз. При 530–540 нм коэффициенты погашения окисленной и восстановленной форм одинаковы, и все кривые пересекаются в одной точке. Анализ спектров показывает, что концентрацию ионов трехвалентного хрома можно с успехом определить фотометрически как по максимуму 447 нм (синий светофильтр), так и в области 590 нм (оранжевый светофильтр). Но первый из максимумов менее удобен по ряду причин: 1) оптическая плотность раствора здесь равна сумме плотностей, хотя последний влияет в незначительной степени; 2) удлинение анализа и расчетов для двухкомпонентных систем (два измерения Dλ вместо одного). Наиболее благоприятна длинноволновая часть спектра, так как здесь: 1) поглощение света раствором бихромата практически равно нулю, а ион Сr3+ дает хорошо очерченный максимум; 2) при 590 нм мы непосредственно узнаем количество восстановленного хрома, которое эквивалентно общему количеству гумуса (восстановителя) в анализируемой пробе (отпадает необходимость определения углерода «по разности», а, следовательно, и установления исходного количества бихромата).

Методика выполнения анализа спектрофотометрическим методом

Берут навеску подготовленной к анализу почвы – 0,3 г (эта навеска пригодна при содержании гумуса от 0,6–0,8 % до 12–13 %; при большем или меньшем количестве гумуса навеску, соответственно, изменяют). Одновременно ведут холостое определение, которое проводят через все стадии анализа, но в конические колбы вместо почвы вносят небольшое количество прокаленных пемзы или песка.

Переносят навеску в коническую колбу на 100 мл, заливают 20 мл 0,4 н. (по бихромату калия) окислительной смеси, отмеривая раствор бихромата калия мерным цилиндром. Осторожно перемешивают содержимое, закрывают горло колбы маленькой воронкой и кипятят на электроплитке (5 мин) или в сушильном шкафу-термостате (20 мин) с начала момента кипения.

Смесь охлаждают, переносят в мерный цилиндр на 100 мл, ополаскивая колбу дистиллированной водой, и доводят объем до 100 мл, добавляя воду. Для ускорения анализа можно разбавлять смесь прямо в конических колбах. Цилиндр (широкую пробирку или колбу) закрывают пробкой. Смесь хорошо перемешивают и оставляют на ночь.

Прозрачный, отстоявшийся раствор осторожно (не взмучивая осадка) сливают в кювету фотоэлектроколориметра длиной 3 или 5 см. При содержании гумуса до 6–7 % можно пользоваться кюветой 5 см, при большем содержании гумуса – кюветой 3 см. Измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре (при 590 нм) или на фотоэлектроколориметре со светофильтром (610 нм). Устанавливают «нуль» приборов не по воде, а по холостому раствору (прокипяченный и разбавленный раствор окислительной смеси – ставят кювету с «холостым» раствором и устанавливают гальванометр на нуль. Затем помещают для измерения кювету с испытуемым раствором и измеряют оптическую плотность D.

Содержание углерода в процентах рассчитывают по одной из приведенных ниже формул. Общая расчетная формула в данном случае имеет вид

Численные коэффициенты учитывают фактор разбавления и эквивалентный вес углерода. Изменением объема за счет твердой фазы можно пренебречь при величине навески 0,3–0,5 г. Тогда получим:

С,% =0,3•D/ ελlm

Окончательные расчетные формулы получим, подставляя численные значения ε и l:

1) для спектрофотометров при λ = 590 нм:

а) кювета 3 см; С,% = 1,43 D/m;

б) кювета 5 см; С,% = 0,86 D/m;

2) для фотоэлектроколориметра, светофильтр № 7(610 нм):

а) кювета 3 см; С,% = 1,82 D/m;

б) кювета 5 cм; С,% = 1,09 D/m.

Пользуясь графиками и номограммами, можно значительно упростить и ускорить расчеты. Данные анализа по форме заносят в таблицу.

В графическом методе готовят калибровочную шкалу из точно (по навеске) приготовленного 0,2000 н. раствора соли Мора и бихромата калия.

С,% =D•3•100•(100-m/d), ελlm•1000•100

где D – оптическая плотность, ε – молярный коэффициент погашения; l – длина кюветы в см; m – навеска почвы в г; d – удельный вес твердой фазы почвы.

Применение фотометрических методов в отраслевом анализе

Фотометрический анализ находит широкое применение при установлении содержания макро- и микроэлементов в почве. Среди возможных разновидностей фотометрического анализа наибольшее использование в почвоведении находит фотоколориметрия. Этим методом определяют содержание азота, фосфора, железа, меди, марганца, цинка, алюминия, серы и других элементов. В большинстве используемых методик определение этих элементов проводят после фотометрических реакций, в результате которых анализируемые вещества переводят в интенсивно окрашенные соединения.

Макро- и микроэлементы в почве присутствуют в виде различных соединений. Например, азот находится в виде нитратов, нитритов, аммонийных солей, входит в состав органических азотсодержащих соединений. Железо встречается в виде соединений Fe (II) и Fe (III), марганец – в виде соединений двух-, трех- и четырехвалентного марганца и т. д. Для целей практического растениеводства и лесоводства важно знать как общее содержание элементов в почве, так и содержание различных форм элементов. Соотношение между различными формами элементов позволяет судить о процессах формирования почвы, оценивать ее пригодность для обеспечения минерального питания растений. Эту задачу успешно позволяет решить фотоколориметрический метод анализа.

В настоящее время разработаны фотометрические методики, которые позволяют определять общее содержание элементов и содержание каждой из возможных форм. Например, содержание нитратного азота в почве определяют, используя фотометрирование желтого раствора натриевой соли тринитрофенола, которая образуется при реакции нитрата с дисульфофеноловой кислотой в щелочной среде:

C6H3OH(HSO3)2 + 3HNO3 = C6H2OH(NO2)3 + 2H2SO4 + H2O;

дисульфофеноловая тринитрофенол кислота

C6H2OH(NO2)3 + NaOH = C6H2ONa(NO2)3 + H2O.

желтое нитросоединение

Азот аммонийных солей в почве определяют фотометрически по образованию желтого иодида димеркураммония, который образуется при действии реактива Несслера на соли аммония в щелочной среде:

NH4Cl + 2K2HgI4 + 4KOH = NH2Hg2OI + 7KI + KCl + 3H2O.

реактив Несслера иодид димеркураммония

Определению аммонийного азота с использованием реактива Несслера не мешает наличие в почвенных вытяжках нитратов. Фотометрический анализ позволяет определить соединения двух- и трехвалентного железа при их совместном присутствии в почве. Эти данные используют для характеристики окислительно-восстановительных процессов в почве, а также для контроля наличия свободного кислорода.

Сущность анализа заключается в том, что соли Fe (II) образуют с органическим основанием – дипиридилом – комплекс красного цвета. Соединения Fe (III) такого комплекса не образуют и поэтому не мешают определению Fe (II). Сульфосалициловая кислота, наоборот, в кислой среде образует окрашенный комплекс только с соединениями Fe (III).

Метод ИК-спектроскопии используют для идентификации органических гуминовых и фульвокислот, выделяемых из почв различных типов.

Большое число определяемых макро- и микроэлементов делает фотометрический метод анализа незаменимым при физиолого-биохимических исследованиях, особенно для определения в растительных тканях различных химических элементов – калия, фосфора, кальция, серы, цинка, меди, железа, молибдена, бора и марганца.

Техника экспериментальных работ и выбор оптимальных условий фотометрических измерений

Правила работы с кюветами

При выполнении лабораторных работ по фотоколориметрии и спектрофотометрии используют специальные пластмассовые или стеклянные кюветы. Работая с ними, необходимо выполнять следующие правила.

1. Грани кювет, через которые будет проходить световой поток, называют рабочими гранями. На них указана длина кюветы (мм) и нанесена отметка уровня жидкости.

2. Кюветы следует держать за боковые грани, через которые не будет проходить световой поток.

3. Перед работой кюветы необходимо тщательно вымыть и обязательно несколько раз ополоснуть дистиллированной водой.

4. Перед наполнением кювет их следует изнутри ополоснуть заливаемыми растворами. При этом удаляются остатки воды.

5. Растворы в кюветы нужно наливать до специальной горизонтальной отметки на грани кюветы. Нельзя наливать растворы выше этого уровня, так как раствор может пролиться в кюветном отсеке.

6. Перед помещением кювет в кюветодержатель рабочие грани следует протереть фильтровальной бумагой. На них не должно остаться капелек раствора, ворсинок, отпечатков пальцев.

7. Для предотвращения проливания растворов, находящихся в кюветах, перемещение каретки фотоколориметра или спектрофотометра надо осуществлять медленно и плавно.

Выбор оптимальной длины волны света λ

Оптимальной длиной волны света является та длина λmax, при которой наблюдается максимальное светопоглощение Аmax. При этом величина коэффициента поглощения будет наибольшей, поэтому возможны определения при низких концентрациях. Это, в свою, очередь важно для соблюдения закона Бугера – Ламберта – Бера.

Для выбора длины волны или светофильтра следует использовать самый концентрированный из градуировочных растворов и раствор сравнения, который содержит все компоненты пробы, кроме определяемого. Если длина кюветы не указана в описании лабораторной работы, то из набора кювет выбирают две одинаковые: длиной 0,5 или 1,0 см.

Одну кювету заполняют раствором сравнения, а другую – раствором определяемого компонента. С помощью спектрофотометра или фотоколориметра измеряют оптическую плотность раствора при различных длинах волн, начиная с 350 нм и заканчивая 700 нм. Если в фотоколориметре используются светофильтры, то необходимо последовательно измерить оптическую плотность раствора со всеми светофильтрами.

1. Назовите основные узлы спектрофотометра. Какие монохроматоры используют в спектрофотометрах?
2. Аналитические возможности метода спектрофотометрии.
3. Какие приемы определения неизвестной концентрации можно использовать в спектрофотометрии?
4. Спектры поглощения и их происхождение. Особенности моле- кулярных спектров поглощения.
5. Основные законы светопоглощения: закон Бугера – Ламбер- та – Бера и закон аддитивности. Условия выполнения закона Бугера – Ламберта – Бера и причины отклонения от него.
6. Классификация методов молекулярной абсорбционной спек- троскопии. Спектрофотометрия и фотоколориметрия: особенности и аналитические возможности методов.
7. Спектральные приборы: устройство и принцип работы.
8. Условия и этапы фотометрических измерений.
9. Приемы установления неизвестной концентрации в спектро- фотометрии и фотоколориметрии.

1. Перечислить важнейшие цели и задачи инструментального анализа;
2. Какие методы инструментального анализа Вам известны? Какой параметр определяет аппаратура каждого из названных методов?
3. Какие ошибки могут подстерегать лаборанта при выполнении им инструментального анализа?
4. Перечислить условия получения надежных результатов инструментального анализа;
5. Как выявить грубые ошибки (промахи) анализа?
6. При определении железа в руде получены следующие результаты, (%): 53,50; 53,00; 52,50; 52,40 и 51,10 %. Выполнить статистическую обработку экспериментальных данных и определить доверительный интервал среднего значения
7. Организация работы в лабораториях инструментального анализа, техника безопасности.

Основными методами фотометрии являются колориметрия, фотоэлектроколориметрия и спектрофотометрия. Колориметрия, фотоэлектроколориметрия и спектрофотометрия базируются на основном законе фотометрии – законе светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера, но если колориметрия и фотоэлектроколориметрия основаны на измерении поглощения света окрашенными растворами в видимой части спектра, то спектрофотометрия использует не только видимую часть спектра, но и примыкающие к ней ультрафиолетовый и инфракрасный участки спектра (см. рис.), то есть диапазон используемых спектрофотометрией волн много шире диапазона волн, который используют колориметрия и фотоэлектроколориметрия.

Фотоэлектроколориметрия

В отличие от визуальной колориметрии, где результат анализа был невысок и в значительной степени являлся субъективным, в фотоэлектроколориметрии интенсивность окраски цветного раствора измерялась прибором фотоэлектроколориметром, и результат фотометрических определений оказывался более точным.

Фотоэлектроколориметрия – фотометрический метод анализа, количественно определяющий содержание компонента в пробе на основании измерения оптической плотности окрашенных растворов специальными приборами – фотоэлектроколориметрами.

Фотоэлектроколориметр определяет интенсивность окраски цветного раствора с помощью фотоэлемента. Фотоэлемент – слой полупроводника (сульфид серебра, селен и др.) – прибор, в котором световая энергия преобразуется в электрическую. Преобразование световой энергии в электрическую в фотоэлементе связано с явлением фотоэффекта.

Фотоэффект – это отрыв электронов от атомов различных веществ под влиянием световой энергии. В результате фотоэффекта возникает фотоэлектрический ток, величина которого прямопропорциональна падающему лучистому потоку. В связи с этим отношение интенсивностей потоков в математическом выражении закона Бугера-Ламберта-Бера может быть заменено отношением фототоков. Фотоэлектроколориметры (ФЭКи) – приборы с двумя фотоэлементами, включенными по принципу противотока, cпектрофотометры – приборы с одним фотоэлементом.

Световой поток, попадая на фотоэлемент, возбуждает в нем электрический ток, который регистрируется включенным в цепь чувствительным гальванометром (или амперметром), отклонение стрелки которого пропорционально освещенности фотоэлемента. Помышленностью выпускались разные модели фотоэлектроколориметров. Хорошо зарекомендовали себя фотоэлектроколориметры серии КФК (рис).

Устройство и принцип работы фотоэлектроколориметров серии КФК

Принцип работы фотоэлектроколориметров серии КФК можно пояснить на его оптической схеме, представленной на рис. 3.8. Световой поток, поступающий от источника света (1) проходит последовательно через конденсатор (2), диафрагму (3), линзы объектива (4), светофильтр (5) и затем попадает в кюветное отделение. Проходя через кювету (6) с раствором, часть светового потока поглощается окрашенным раствором, часть отражается от внешней стороны стенок кюветы и, таким образом, на выходе из кюветы интенсивность светового потока падает. Далее световой поток поступает через защитное стекло (7) на пластинку (9), направляющую его на фотоэлемент (10) при работе с длинами волн 315 – 540 нм или на фотодиод (8) при работе с длинами волн 590 – 980 нм. Изменение интенсивности светового потока вызывает пропорциональное изменение силы тока, которое регистрируется гальванометром (или микроамперметром).

Строение света. Выбор длины волны света для фотометрического анализа

Свет не является монохроматическим (см. рис.), он состоит из лучей очень широкой области спектра, от супер-коротких космических лучей, через видимую часть спектра к ультра-длинным радиоволнам, то есть лучей разной длины волны. Свет, проходящий через раствор, также не монохроматичен. Окрашенный раствор поглощает свет избирательно, поэтому фотометрирование окрашенных растворов необходимо проводить, пропуская через раствор свет определенной длины волны, такой, при которой светопоглощение происходит наиболее полно. Таблица 3.1. показывает, какой длины волны свет необходимо выбрать при фотометрировании растворов определенной окраски.

Правильный выбор нужной длины волны (см. таблицу 3.1.) очень важен для результатов фотометрического анализа. Так, неодинаковость поглощения света различно окрашенными растворами учитывается и при проведении фотоэлектроколориметрического анализа, где очень важен правильный подбор соответствующего светофильтра.

Подбор светофильтра для фотометрического анализа Светофильтр – окрашенная пленочная или стеклянная пластинка, пропускающая лучи только определенной области спектра. Все фотоэлектроколориметры снабжены светофильтрами, так как окрашенный раствор видимые лучи поглощает избирательно и в видимом спектре этих соединений наблюдаются полосы поглощения. Учитывая это, при фотоколориметрировании стараются выбрать узкую часть спектра. Достичь этого и помогает использование окрашенных светофильтров – светофильтры пропускают лишь ту часть спектра, которая поглощается окрашенным раствором.

Светофильтры подбирают, руководствуясь таблицей Более точно светофильтр (а также длину кюветы) подбирают опытным путем. Подбор кюветы для фотометрического анализа Кроме выбора светофильтра необходим, также, выбор концентраций фотометрируемых растворов и длины кюветы. Кюветы (рис. 3.12.) могут быть выполнены из органического пластика или специального оптического стекла и иметь все четыре прозрачные пропускные стенки, либо только две пропускные, а две матовые. Если кювета не имеет матовых стенок, то брать и переносить ее можно, удерживая только за ребра, так как при удерживании кюветы пальцами за пропускную стенку на последней остаются дактилоскопические следы пальцев удерживающего кювету, вследствие чего светопоглощение такой кюветы будет завышено. Кювету с матовыми стенками можно удерживать и переносить только за матовые стенки, оставляя пропускные нематовые стенки кюветы абсолютно чистыми. Концентрация же фотометрируемого раствора должна быть такой, чтобы его оптическая плотность находилась в пределах приблизительно от 0,2 до 0,5. При указанных значениях оптической плотности относительная ошибка определения концентрации на всех типах приборов будет минимальной.

Относительная ошибка определения концентрации раствора будет различной при работе на разных участках шкалы прибора и достигает минимума при значении оптической плотности 0,4. Поэтому при работе на приборе необходимо путем соответствующего выбора кювет работать вблизи указанного значения оптической плотности раствора. Предварительный выбор кювет проводят визуально, сообразно интенсивности окраски раствора: если раствор окрашен интенсивно (темный), следует пользоваться кюветой с малой рабочей длиной (1 – 3 см), в случае же слабо окрашенных растворов – с большей рабочей длиной (3 – 5 см). При измерении ряда растворов кювету заполняют раствором средней концентрации. Если полученное значение оптической плотности лежит в интервале 0,3 – 0,5 – данную кювету выбирают для работы.

Спектральные методы

Все спектральные методы, применяемые в химическом анализе почв, основаны на взаимодействии различных типов электромагнитного излучения (инфракрасного, видимого, ультрафиолетового, рентгеновского) с анализируемой пробой и на регистрации изменений, произошедших с потоком этого излучения после взаимодействия с анализируемым веществом. Спектральные методы, используемые в химическом анализе почв, делятся на две большие группы: молекулярную и атомную спектрофотометрню. Методы атомной спектрофотометрии, в свою очередь, делятся на методы эмиссионной и абсорбционной спектрофотометрии.

Таблица. Методы молекулярной спектроскопии

Фосфор является одним из основных элементов питания растений. Его содержание в растениях значительно ниже, чем азота, калия, и кальция. Недостаточное содержание в почве усвояемых фосфатов обусловливает низкие урожаи. Вместе с тем, на почвах с достаточно высоким содержанием легкорастворимых фосфатов внесение под культуры суперфосфата при посеве обеспечивает существенный прирост урожайности.

В отличие от минеральных форм почвенного азота, которые неустойчивы и легко теряются в результате улетучивания и вымывания почвенные фосфаты весьма устойчивы. Причиной недостатка фосфора для растений является низкая растворимость фосфорных соединений

Недостаток фосфора вызывает последствия, которые аналогичны последствиям недостатка азота. Стебли бывают тонкими, листья мелкими, боковое ветвление ограниченное. Развитие почек весной задерживается, цветение скудное, происходит преждевременное опадение листьев. Так же, как и азот, фосфор реутилизируется в растении. Он оттекает из взрослых листьев в молодые.

2. Формы фосфора в почве, их доступность растениям

Основной формой минерального фосфора в почве являются апатиты - природные и вторичнообразованные. Минеральные формы находятся преимущественно в виде соединений ортофосфорной кислоты с ионами кальция, магния, железа и алюминия. Значительная доля ионов фосфора адсорбируется на положительно заряженной части почвенного поглощающего комплекса (базоидами). Адсорбированные ионы фосфора удерживаются прочнее катионов.

В почве одновременно протекают разнонаправленные процессы. Происходят иммобилизация органическим веществом фосфора почвенного раствора и минерализация органических веществ, которая сопровождается поступлением фосфора в почвенный раствор. В почвенный раствор поступает фосфор в результате десорбции его из минеральных соединений, и происходит сорбция (осаждение) фосфатов почвенного раствора минеральной частью почвы.

Уровень фосфорного питания растений зависит от растворимости минеральных форм фосфора. Характер реакции почвенного раствора обусловливает преобладание одного из трех ионов фосфора. В интервале кислых и нейтральных почв преобладает монофосфат – одновалентный ортофосфат – H₂PO₄, в щелочной среде – при pH выше 7,2 доминирует двухвалентный ион HPO₄. Ион PO₄ появляется при pH выше 10. Наиболее легко абсорбируется растениями монофосфат. Количество фосфора в почвенном растворе (H₂PO₄, H₂PO₄), как правило не превышает 1 кг/га пахотного слоя почвы.

Считается, что растения почти весь необходимый для них фосфор извлекают из почвенного раствора. На формирование урожая 1ц/га зерна яровой пшеницы затрачивается около одного килограмма фосфора. Следовательно, содержание фосфатов в почвенном растворе постоянно восполняется. Адсорбированный и другие твердые формы фосфора находятся в равновесном состоянии с фосфором почвенного раствора и между собой. Концентрация почвенного раствора сохраняется. При этом фосфору свойственна более низкая концентрация в почвенном растворе, чем азоту и калию, а также и низкая скорость диффузии. Поскольку основное перемещение фосфора к корням растений осуществляется при диффузии ионов, то в сухой почве, когда расстояние перемещения иона превышает 5-10мм, поглощение фосфора растением замедляется (Томпсон, Троу,1982).

Лучше всего растениями усваивают воднорастворимые фосфаты. Но воднорастворимых солей фосфорной кислоты в почвах обычно так мало, что по их количеству нельзя судить о степени обеспеченности растений фосфором. В связи с этим определение количества фосфатов, переходящих в водную вытяжку из почвы, не дает правильного ответа на то, сколько фосфора находится в почве в форме, доступной для растений. Для оценки уровня обеспеченности растений фосфором используются показатели экстракции фосфатов из почвы различными растворителями: кислотными, щелочными разной концентрации, а также растворами солей, которые извлекают из почвы воднорастворимые фосфаты и часть соединений фосфора не растворяющихся в воде. Агрохимической службой используются: на нейтральных почвах (черноземного типа) 0,5н уксуснокислую вытяжку по Чирикову, на почвах элювиального ряда (серые лесные, дерново-подзолистые) – 0,2 н солянокислую вытяжку по Кирсанову, на карбонатных почвах (черноземах южных, обыкновенных, каштановых почвах) в 1% растворе углекислого аммония по Мачигину.

При расчете доз фосфорных удобрений необходимо учитывать обеспеченность почвы доступными для растений формами фосфатов. Полученные результаты оценивают, пользуясь местными градациями к методам определения подвижных фосфатов в почве по Кирсанову, Чирикову, Мачигину (таблица 7).

Таблица 1 - Содержание подвижного фосфора в почвах разных почвенно-климатических зон

Класс обеспеченности	Почвенно-климатические зоны	P2O5, мг/100 г почвы
		По Кирсанову	По Чирикову	По Мачигину
1	Канская, Красноярская, Минусинская лесостепи с прилегающей южной тайгой и степью	<15	<10	<1
2		15-20	10-15	1-2
3		20-25	15-20	2-3
4		25-30	20-25	3-4,5
5		30-35	25-30	4,5-6
6		35-40	30-35	6-8
7*		40-45	35-40	8-10
8*		>45	>40	>10
1	Ачинско-Боготольская, Чулымо-Енисейская лесостепи и прилегающая южная тайга	<5	<2,5	<1
2		5-10	2,5-5	1-2
3		10-15	5-10	2-3
4		15-20	10-15	3-4,5
5		20-25	15-20	4,5-6
6		25-30	20-25	6-8
7*		30-35	25-30	8-10
8*		>35	>30	>10

Примечание: 7-й и 8-й классы только для овощных культур и корнеплодов

При высокой доступности почвенного фосфора молодые растения быстро поглощают фосфор. При синтезе четверти органической массы они успевают поглотить до 50% всего нужного им количества фосфора за сезон. Зерновые культуры на 7-10 дней ускоряют наступление технологической спелости. Высокая обеспеченность фосфором начальной фазы роста яровой пшеницы обусловливает существенный прирост урожайности за счет повышения озерненности колоса.

Фосфор противодействует влиянию азота на усиление поражения ячменя мучнистой росой. Поражение грибными гнилями корней значительно выше у растений недостаточно обеспеченных фосфором. Эта тенденция проявляется интенсивнее у растений в стадии проростков. Вместе с тем есть сведения и обратного порядка: восприимчивость к болезни проявляется больше при достаточном обеспечении фосфором, чем тогда, когда в почве складывается дефицит фосфора.

Определение подвижных фосфатов по методу Чирикова

Материалы и оборудование: весы технические, колбы на 250 и 50 мл, воронки, бумажные фильтры, почвенные образцы, реактивы для выделения подвижных фосфатов:0,5 н уксусная вытяжка, 0,2 н солянокислая вытяжка, фотоэлетроколориметр.

Принцип и химизм метода

Почвенные фосфаты, взаимодействуя с молибденовокислым аммонием в сильнокислой среде (в присутствии аскорбиновой кислоты и ли хлористого олова), образуют комплексную соль голубой окраски. Интенсивность окраски ее пропорциональна содержанию подвижных фосфатов.

Ход анализа

Построение графика и расчеты. Для построения калибровочного графика в мерные колбы на 100мл берут возрастающие количества (5,10,15,20,25,30мл) стандартного раствора KHPO₄. Доливают до метки реактивом «С» по Чирикову, встряхивают и через 10минут определяют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре. По полученным результатам строят график, по которому, согласно оптической плотности раствора, находят объем стандартного раствора и рассчитывают содержание подвижных фосфатов по формуле:

P₂O₅= a*b*V₁*100/V₂*C, где

а – отсчет по графику, мл;

b – титр стандартного раствора;

V₁ - объем уксусной кислоты, взятый для приготовления вытяжки, мл;

100 – коэффициент пересчета на 100 г почвы;

V₂ - объем вытяжки, взятый для определения оптической плотности, мл;

С – навеска почвы, г.

Определение подвижных фосфатов по методу Кирсанова

Принцип и химизм метода определения подвижных фосфатов по методу Кирсанова основан на извлечении соединений фосфора из почвы раствором соляной кислоты молярной концентрации, равной 0,2 моль/дм³, при отношении почвы к раствору 1:5 с последующим определением фосфора в виде синего фосфорно-молибденового комплекса на фотоэлектроколориметре.

Ход анализа.

Навеску почвы 5г переносят в коническую колбу емкостью 100мл, заливают 25мл 0,2н соляной кислотой, взбалтывают 1минуту и отстаивают 15 минут, после чего вытяжку фильтруют. 1-2 мл прозрачного фильтрата переносят в мерную колбу на 50 мл и доливают до метки реактивом «С» по Кирсанову. Содержимое колбы взбалтывают и через 10 минут определяют оптическую плотность окрашенного раствора на фотоэлектроколориметре.

Построение графика и расчеты. Для построения калибровочного графика в мерные колбы на 100мл берут возрастающие количества (5,10,15,20,25,30мл) стандартного раствора KHPO₄. Доливают до метки реактивом «С» по Кирсанову, встряхивают и через 10 минут определяют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре. По полученным результатам строят график, по которому, согласно оптической плотности раствора, находят объем стандартного раствора и рассчитывают содержание подвижных фосфатов по формуле:

P₂O₅= a*b*V₁*100/ V₂*C, где

а – отсчет по графику, мл;

b – титр стандартного раствора;

V₁ - объем уксусной кислоты, взятый для приготовления вытяжки, мл;

100 – коэффициент пересчета на 100 г почвы;

V₂ - объем вытяжки, взятый для определения оптической плотности, мл;

С – навеска почвы, г.

Обсуждение результатов. При выполнении лабораторной работы каждый студент получает индивидуальный почвенный образец. На основании полученных результатов:

1. рассчитайте содержание почвенных фосфатов в почве;
2. оцените обеспеченность почвы фосфором по местным градациям;
3. оформите в рабочей тетради выводы и обоснуйте полученные результаты

Контрольные вопросы

Контрольные вопросы

1. Назовите основные узлы спектрофотометра. Какие монохроматоры используют в спектрофотометрах?
2. Аналитические возможности метода спектрофотометрии.
3. Какие приемы определения неизвестной концентрации можно использовать в спектрофотометрии?
4. Спектры поглощения и их происхождение. Особенности моле- кулярных спектров поглощения.
5. Основные законы светопоглощения: закон Бугера – Ламбер- та – Бера и закон аддитивности. Условия выполнения закона Бугера – Ламберта – Бера и причины отклонения от него.
6. Классификация методов молекулярной абсорбционной спектроскопии. Спектрофотометрия и фотоколориметрия: особенности и аналитические возможности методов.
7. Спектральные приборы: устройство и принцип работы.
8. Условия и этапы фотометрических измерений.
9. Приемы установления неизвестной концентрации в спектро- фотометрии и фотоколориметрии.