Тема 2.4. Определение показателей (белки, жиры, клетчатка, крахмал, зола) в зерне и кормах методом инфракрасной спектрометрии

Метод инфракрасной спектроскопии является одним из важнейших современных физических методов исследования органических соединений. ИК спектры большинства органических соединений дают богатый набор полос поглощения, отвечающий колебаниям почти всех функциональных групп. инфракрасная область в общем электромагнитном спектре занимает диапазон 5000 – 200 см-1. В координатах интенсивность поглощенного излучения - волновое число ик спектр представляет собой сложную кривую с большим числом максимумов и минимумов. полосы поглощения появляются в результате переходов между колебательными уровнями основного электронного состояния изучаемой системы. спектральные характеристики (положение максимумов полос, их полуширина, интенсивность) индивидуальной молекулы зависят от масс составляющих ее атомов, геометрического строения, особенностей межатомных сил, распределения заряда и др. поэтому ик спектры отличаются большой индивидуальностью, что и определяет их ценность при идентификации и изучения строения соединений.

Инфракрасная спектроскопия широко применяется для анализа смесей и идендификации чистых веществ. количественный анализ основан на законе Бугера – ламберта – Бера. при этом о количестве вещества судят не по отдельным полосам поглощения, а по спектральным кривым в целом в широком диапазоне длин волн. если число компонентов невелико (4 – 5), то удается математически выделить их спектры даже при значительном перекрывании последних. идентификация чистых веществ производится обычно с помощью информационно-поисковой системы путем автоматического сравнения анализируемого спектра со спектрами, хранящимися в памяти ЭВМ.

Знакомство с методами и приемами подготовки проб в ИК спектроскопии.

Разнообразие приемов подготовки проб для съемки ИК-спектров почти беспредельно, и исследователь должен выбрать один из них, наилучшим образом подходящий для решения конкретной проблемы с учётом свойств исследуемого объекта. Здесь представлены некоторые основные приёмы пробоподготовки.

В связи с тем что физическое состояние образца может сильно влиять на его ИК-спектр, целесообразно заранее определить иерархию используемых приемов Последовательность их применения определяется поставленными перед исследователем задачами. Например, в лаборатории, проводящей химические работы общего характера, спектры жидких нелетучих проб целесообразно снимать в виде жидких плёнок или раздавленных между солевыми пластинками капель. ИК спектры летучих жидкостей регистрируют в тонких кюветах или в виде растворов, если вещество растворимо, при этом необходимо учитывать собственное поглощение растворителя. Для органических порошкообразных веществ логична следующая последовательность: 1) суспензия в вазелиновом масле (или другом разбавителе), 2) таблетка с КВr или спектр диффузного отражения, 3) раствор, 4) пиролизат. Такие методы, как нарушенное полное внутреннее отражение (НПВО), обычно оставляют для исследования специальных случаев (например, полимерных материалов).

Жидкие пробы.

Одним из простейших приемов приготовления образцов является метод жидкой пленки. Он применяется для получения качественных обзорных спектров нелетучих, нереакционноспособных, нерастворимых жидкостей. Капля вещества сжимается между двумя солевыми пластинками или помещается на плоскую стеклянную поверхность, а затем “вытирается” солевой пластинкой. Желательно, чтобы в пределах сечения светового луча спектрометра толщина образца была более или менее одинаковой, без воздушных пузырьков. Очевидно, что спектры, полученные таким путем, не очень воспроизводимы, и не пригодны для количественной обработки (толщина поглощающего слоя неизвестна). Для получения спектров растворимых в летучих растворителях смол или лаков тонкий слой соответствующего раствора, нанесенного на солевое окно, аккуратно высушивают под тепловой лампой, феном или в вакуумном эксикаторе, добиваясь полного удаления растворителя.

В некоторых случаях исследователи предпочитают приготовление проб в виде растворов, хотя этот метод более трудоемок, чем другие, его преимущество заключается в высокой воспроизводимости и в возможности выполнять количественные измерения. Требования к растворителям. Выбор растворителя всегда является результатом компромисса. Так как все стандартные органические растворители имеют ИК спектры, то необходимо выбирать те из них, в которых вещество достаточно хорошо растворимо и которые имеют окна прозрачности в аналитических областях спектра. Растворитель должен быть химически инертным, поддаваться очистке и осушке. В тех областях спектра, где пропускание растворителя падает ниже 30%, чувствительность измерений будет понижена, а шумы и погрешности измерений будут возрастать.

Выбор концентрации. Большинство органических веществ дает приемлемые спектры в области 625 – 4000 см-1 в кювете толщиной 0,1 мм при концентрациях около 1 г /10 мл. При работе ниже 600 см-1 могут понадобиться более высокие концентрации. В случае сильнопоглощающих фтор- или кремнийорганических соединений концентрация может быть снижена до 0,2 г /10 мл. Для содержащих полярные группы соединений нужно иметь ввиду возможность проявления в спектрах межмолекулярных взаимодействий (например, водородных связей).

Толщина поглощающего слоя. На выбор толщины кюветы может влиять количество имеющегося в распоряжении образца или его растворимость. Очень тонкие кюветы (<0,05 мм) трудно изготавливать, заполнять и опорожнять, а в кюветах толщиной более 0,2 мм поглощение растворителя может оказаться слишком сильным. Удобными для работы являются кюветы толщиной 0,1 мм. В специальных случаях для анализа следовых количеств в узких областях высокой прозрачности растворителя могут использоваться кюветы с толщиной поглощающего слоя Б.Н.Тарасевич, «Основы ИК спектроскопии с преобразованием Фурье». Перед приготовлением образца с большой толщиной поглощающего слоя, необходимо проверить, пропускание растворителя и убедиться в его чистоте. Проверка кюветы В процессе длительного использования окна жидкостной кюветы могут помутнеть или загрязниться. О состоянии окон не всегда можно судить по их внешнему виду, поэтому необходимо контролировать чистоту окошек и кювет, записывая их спектры. Регулярная проверка спектра кюветы может сберечь спектроскописту много бесплодных часов на попытки идентифицировать ложные полосы.

В настоящее время во многих странах мира для оперативного (экспрессного) анализа целого ряда показателей качества некоторых видов сельскохозяйственной продукции достаточно широко применяется метод спектроскопии в ближней инфракрасной области. Инструментальной базой спектрального анализа являются специальные приборы: инфракрасные анализаторы (ИК-анализаторы) и спектрофотометры.

Основными достоинствами для всех известных приборов являются:

• значительное сокращение времени на проведение анализа;

• существенная экономия энергоресурсов;

• приборы не требуют применения дорогостоящих расходных материалов и химических реактивов;

• гораздо менее жесткие требования по специальной подготовке предъявляются к обслуживающему персоналу, производящему рутинные измерения (по сравнению с их коллегами, осуществляющие традиционные лабораторные методы анализа).

В мировой практике ИК-анализаторы достаточно широко используются для анализа качества зерна пшеницы и ячменя, сои, масличных культур, комбикормов, молока и т. д. Но для российского производителя сельскохозяйственной продукции вопрос о приобретении для своего предприятия таких приборов на сегодняшний день остается открытым.

Во всех возможных областях использования метода ИК-спектрскопии существует целый ряд законодательных, технических, метрологических и методических особенностей применения приборов, поэтому задача выбора является многофакторной.

Рассмотрим перспективы использования ИК-анализаторов для оценки качества некоторых видов зерновых культур в условиях нынешнего состояния развития сельского хозяйства Российской Федерации. Помимо собственных планов предприятия, необходимо принять во внимание следующие факторы: реализацию целевой программы развития сельского хозяйства и предполагаемое в ближайшем будущем вступление страны в ВТО.

Серьезным препятствием для широкого использования на практике метода инфракрасной спектроскопии является сложившаяся законодательная неопределенность. Вопреки ожиданиям, новых, регламентирующих показатели и методы определения качества сельскохозяйственной продукции и в частности зерновых культур документов так и не появилось. Кроме того, известно, что все ныне действующие государственные стандарты носят рекомендательный характер, да и ВТО нет единых взглядов на показатели качества зерна. Разобраться в такой ситуации достаточно сложно.

С точки зрения метрологии, необходимо, прежде всего, иметь представления о точности и воспроизводимости результатов измерений для конкретного вида продукции по определенным показателям. Другой, не менее важный аспект - экономический. Желательно получить ясный ответ на вопрос - на сколько выгодно иметь такой прибор, каков возможный экономический эффект от его применения?

Таким образом, мы должны более подробно рассмотреть следующие аспекты решаемой задачи:

Рассмотреть законодательную базу для использования спектральных приборов.

Оценить достоверность получаемых результатов.

Выяснить экономическую целесообразность применения приборов.

С этой целью необходимо познакомиться с рынком спектральных приборов и попытаться выработать критерии для выбора прибора для своего предприятия

Метод инфракрасной спектроскопии является универсальным физико-химическим методом, который применяется в исследовании структурных особенностей различных органических и неорганических соединений. Метод основан на явлении поглощения группами атомов испытуемого объекта электромагнитных излучений в инфракрасном диапазоне. Поглощение связано с возбуждением молекулярных колебаний квантами инфракрасного света. При облучении молекулы инфракрасным излучением поглощаются только те кванты, частоты которых соответствуют частотам валентных, деформационных и либрационных колебаний молекул.

Для регистрации спектров поверхности твердых тел применяют метод нарушенного полного внутреннего отражения. Он основан на поглощении поверхностным слоем вещества энергии электромагнитного излучения, выходящего из призмы полного внутреннего отражения, которая находится в оптическом контакте с изучаемой поверхностью. Инфракрасная спектроскопия широко применяют для анализа смесей и идентификация чистых веществ.

Идентификация чистых веществ производится обычно с помощью информационно-поисковых систем путем автоматического сравнения анализируемого спектра со спектрами, хранящимися в памяти ЭВМ. Для идентификации новых веществ (молекулы которых могут содержать до 100 атомов) применяют системы искусственного интеллекта. В этих системах на основе спектроструктурных корреляций генерируются молекулярные структуры, затем строятся их теоретические спектры, которые сравниваются с экспериментальными данными. Исследование строения молекул и др. объектов методами инфракрасной спектроскопии подразумевает получение сведений о параметрах молекулярных моделей и математически сводится к решению обратных спектральных задач. Решение таких задач осуществляется последовательным приближением искомых параметров, рассчитанных с помощью специальной теории спектральных кривых к экспериментальным.

Параметрами молекулярных моделей служат массы составляющих систему атомов, длины связей, валентные и торсионные углы, характеристики потенциальной поверхности (силовые постоянные и др.), дипольные моменты связей и их производные по длинам связей и др. Инфракрасная спеткроскопия позволяет идентифицировать пространственные и конформационные изомеры, изучать внутри- и межмолекулярные взаимодействия, характер химических связей, распределение зарядов в молекулах, фазовые превращения, кинетику химических реакции, регистрировать короткоживущие (время жизни до 10-6 с) частицы, уточнять отдельные геометрические параметры, получать данные для вычисления термодинамических функций и др.

Необходимый этап таких исследований - интерпретация спектров, т.е. установление формы нормальных колебаний, распределения колебательной энергии по степеням свободы, выделение значимых параметров, определяющих положение полос в спектрах и их интенсивности. Расчеты спектров молекул, содержащих до 100 атомов, в том числе полимеров, выполняются с помощью ЭВМ. При этом необходимо знать характеристики молекулярных моделей (силовые постоянные, электрооптические параметры и др.), которые находят решением соответствующих обратных спектральных задач или квантовохимическими расчетами. И в том, и в другом случае обычно удается получать данные для молекул, содержащих атомы лишь первых четырех периодов периодической системы. Поэтому инфракрасная спектроскопия как метод изучения строения молекул получил наибольшее распространение в органической и элементоорганической химии. В отдельных случаях для газов в инфракрасной области удается наблюдать вращательную структуру колебательных полос. Это позволяет рассчитывать дипольные моменты и геометрические параметры молекул, уточнять силовые постоянные и т.д.

Инфракрасная спектроскопия имеет ряд преимуществ перед спектроскопией в видимой и ультрафиолетовой областях, так как позволяет проследить изменение всех основных типов связей в молекулах исследуемых веществ. При использовании инфракрасной спектроскопии для определения качественного и количественного состава природных смесей не происходит разрушение веществ, что позволяет применять их для последующих исследований. Как известно, при инфракрасной спектроскопии в диапазоне каждой химической группировке органической молекулы соответствует определенный набор полос поглощения, которые хорошо изучены и приведены в соответствующих справочниках. При этом следует отметить, что в процессе снятия инфракрасного спектра создаются помехи на определенных длинах волн, связанные с поглощением электромагнитного излучения связями растворителей О-Н и С-Н.

Инфракрасный спектр биологического образца представляет собой суммарный спектр, в котором происходит наложение полос поглощения различных функциональных групп органических веществ а также воды. Это явление усложняется в виду взаимодействия отдельных видов колебаний указанных групп, при этом происходит искажение формы полос поглощения и смещение их максимумов. Поэтому на инфракрасных спектрах наблюдается большое число широких полос поглощения с неясными максимумами. Обычно расшифровка инфракрасных спектров биологических образцов весьма затруднительна, поэтому, чтобы облегчить расшифровку суммарного спектра, необходимо разделять биологический образец на более простые компоненты. Это дает возможность получить большее число полос поглощения для исследуемого вещества и более точно определить состав компонентов в образце.

Положительной особенностью метода инфракрасной спектроскопии является то, что полосы поглощения одного и того же вида колебаний атомной группы различных веществ располагаются в определенном диапазоне инфракрасного спектра (например, 3720-3550 см-1- диапазон валентных колебаний групп -ОН; 3050-2850 см-1 - групп -СН, -СН2, -СН3 органических веществ). Точное положение максимума полосы поглощения атомной группы в пределах этого диапазона указывает на природу вещества (так, максимум 3710 см-1 свидетельствует о наличии групп -ОН, а максимум 3030 см-1 - о присутствии групп =С-Н ароматических структур).

Приготовление образцов

ИК-спектры могут быть записаны для газообразных, жидких и твердых веществ. Для измерения спектров газообразных соединений используются специальные газовые кюветы.

Жидкие соединения наносят в виде пленки на пластинки из материала, прозрачного в исследуемой области (например, KBr, NaCl). Толщина поглощающего слоя обычно устанавливается от 0,005 до 0,1 мм. Инфракрасные спектры могут быть измерены и для растворов. Поскольку не имеется растворителей, прозрачных по всей области спектра, то обычно измерения ИК - спектров растворов делаются только для узких областей. Для исследования водных, кислых и щелочных растворов используют кюветы из водонерастворимых материалов (флюорит, кремний, германий и другие материалы, прозрачные в ИК-области).

Съемка спектров поглощения порошкообразных и мелкокристаллических веществ усложнена тем, что грани частичек, расположены хаотично по направлению к падающему свету и от них происходит отражение и преломление света по всем направлениям, т.е. происходит рассеяние света. Если пространство между частичками заполнить жидкостью, показатель преломления, которой близок к их показателю преломления, то полное внутреннее отражение резко уменьшается и первоначальный ход лучей не будет искажаться. Такие жидкости называются иммерсионными. В качестве иммерсионных сред можно использовать и пластичные твердые вещества, которые под давлением заполняют пустоты между частичками исследуемого вещества.

Обычно применяются следующие методики: растирание вещества с инертными жидкостями или прессование таблеток с бромистым калием или полиэтиленом. Из твердых веществ приготавливают суспензию в вазелиновом масле, которую помещают между солевыми пластинками. Для приготовления взвесей (суспензий или паст) в качестве иммерсионной среды используется вазелиновое масло – высококипящая фракция углеводородов (за рубежом используется подобное же масло под названием «нуйол»).

Приготовление взвесей производится следующим образом. Образец (5 - 10 мг) тщательно растирают в небольшой агатовой или яшмовой ступке в течение 4 – 10 минут и добавляют в конце растирания 1 – 2 капли иммерсионной жидкости. Получившуюся суспензию наносят на окно из NaCl или KBr и прижимают другим окном. При этом необходимо стараться, чтобы суспензия равномерно растеклась к краям, образуя тонкую пленку без пузырьков воздуха. Чтобы повысить контрастность спектра, в канал сравнения ставится кювета сравнения с вазелиновым маслом.

Кроме данной методики используется метод взвесей в KBr, называемый еще методом прессования таблеток. Он заключается в тщательном перемешивании тонкоизмельченного образца с порошком KBr (или другим галогенидом щелочного металла) в соотношении 1:100 с последующим прессованием смеси в пресс-форме. В результате чего получаются тонкие круглые или прямоугольные, прозрачные или полупрозрачные таблетки. Растирание образца проводят в агатовой или яшмовой ступке.

Преимущества метода прессования таблеток следующие: 1) отсутствие большинства мешающих полос поглощения; 2) возможность контроля за концентрацией образца; 3) удобство хранения образца. Недостатками метода является возможное взаимодействие вещества с атмосферными водой и углекислым газом, а также с KBr в ходе приготовления таблетки, что приводит к искажению спектра.

Методику прессования таблеток с KBr целесообразно применять для образцов, которые: 1) нерастворимы в обычных ИК – растворителях; 2) аморфны или имеют устойчивую кристаллическую структуру; 3) не содержат ионов, способных к обмену.

Принципы устройства и действия ИК-Фурье спектрометров

Термин "ИК-Фурье спектроскопия" возник с появлением нового поколения приборов, в основе оптической схемы которых используются различного типа интерферометры. ИК-Фурье спектроскопия представляет собой один из вариантов метода ИК – спектроскопии и по существу не является отдельным спектральным методом. Спектры веществ, полученные на ИК-Фурье спектрометрах, не отличаются от спектров, полученных на диспергирующих ИК-спектрометрах.

Спектры с помощью Фурье-спектрометров получают в два этапа. Сначала регистрируется интерферограмма т.е. выходной световой поток в зависимости от разности хода разделенной на когерентные пучки входной волны от источника. Затем путём обратного преобразования Фурье (по разности хода) вычисляется спектр. Вторая часть требует относительно большого объема вычислений, поэтому метод получил широкое распространение только с появлением современных компьютеров. Однако сложность получения спектров с помощью Фурье-спектрометров значительно перекрывается преимуществами над другими спектральными приборами:

Рассмотрим основные принципы работы ИК-Фурье спектрометров и технику ИК – спектроскопии, с помощью которой исследуются ИК спектры молекул на примере ИК-Фурье спектрометра Nicolet 6700. Оптическая схема спектрометра Nicolet 6700 представлена на рисунке.

Интерферометр содержит два взаимно перпендикулярных зеркала - неподвижное 1 и подвижное 2 и полупрозрачную светоделительную пластину 3, расположенную в месте пересечения падающих пучков излучения и пучков, отраженных от обоих зеркал. Пучок излучения от источника 4, попадая на пластину 3, разделяется на два пучка. Один из них направляется на неподвижное зеркало 1, второй - на подвижное зеркало 2; затем оба пучка, отразившись от зеркал, выходят через светоделитель из интерферометра в одном и том же направлении. Далее излучение фокусируется на образце 5 и поступает на детектор излучения 6. Два пучка отличаются друг от друга оптической разностью хода, величина которой меняется в зависимости от положения подвижного зеркала. В результате интерференции пучков интенсивность результирующего потока I(х) периодически меняется (модулируется). Частота модуляции зависит от частоты падающего излучения  и смещения подвижного зеркала х. В результирующей интерферограмме выделяется так называемая точка нулевой разности хода, или точка белого света. В этой точке для всех частот наблюдается максимум; от нее ведут отсчет смещения подвижного зеркала.

При поглощении образцом излучения с какой-либо частотой наблюдается уменьшение интенсивности интерферограммы, соответствующей этой частоте. После проведения Фурье-преобразования в полученном спектре наблюдается полоса поглощения образца. Преобразование Фурье осуществляют на компьютере.

Внешний вид ИК-Фурье спектрометра Nicolet 6700 показан на рис. 8. Nicolet 6700 состоит из следующих основных частей:

1. Источник излучения - Не - Ne лазер;

2. Кюветное отделение;

3. Оптическая система, включающая систему зеркал и делителей;

4. Интерферометр Майкельсона (Скорость сканирования до 75 сканов/сек);

5. Детектор ИК – излучения. Имеется два детектора: DTGS/KBr (в области 9000 см-1 – 350 см-1) и DTGS/PE (700 см-1 – 50 см-1);

6. Прибор подключен к персональному компьютеру и управляется программой OMNIC, которая работает в среде Windows 98/2000/Me/NT/XP.

Кроме этого в Nicolet 6700 можно использовать различные приставки, которые помещаются в кюветное отделение: на пропускание; диффузное отражение; МНПВО (многократное не полное внутреннее отражение); горизонтальная приставка НПВО, устойчивая к воздействию агрессивных сред.

Так с использованием приставок диффузного отражения или нарушенного полного внутреннего отражения можно исследовать порошки, прозрачные и непрозрачные пленки. Использование метода НПВО основано на том, что на границе раздела фаз образца и оптического материала (кристалла из галогенидов таллия или селенида цинка) возникает "затухающая волна" ИК-излучения, проникающая на некоторую глубину в оптически менее плотную среду (образец), при этом регистрируется спектр пропускания ультратонких верхних слоев образца. Меняя угол падения ИК-излучения, можно последовательно получать спектры более глубоко лежащих слоев при исследовании многослойных пленочных материалов.

Спектр пробы, полученный методом диффузного отражения или методом НПВО, совпадает со спектром пропускания вещества, полученным обычными способами пробоподготовки (например, в таблетке с KBr), по наличию, форме и относительной интенсивности полос поглощения. Поэтому идентификацию вещества можно проводить по спектрам диффузного отражения или по спектрам НПВО.

Контрольные вопросы

Контрольные вопросы

1. В каких областях спектра проявляются переходы между вращательными, колебательными и электронными состояниями молекулы.
2. Как связано волновое число с длиной волны.
3. Переходы между колебательными состояниями молекул проявляются в области примерно от 50 до 4000 см-1. Какова энергия этих переходов, какова спектральная область этих переходов в мкм.
4. Какие колебания линейного уранила проявляются в ИК – спектре.
5. Какую информацию можно получить из ИК – спектров.
6. Что служит источником непрерывного спектра в инфракрасной области спектра.
7. Какой приемник инфракрасного излучения используется в области 2,5 – 50 мкм.
8. Зачем при съемке ИК – спектров поглощения порошкообразных или мелкокристаллических веществ используются иммерсионные среды вазелинового масла или KBr.
9. В какой области спектра работает спектрометр Nicolet 6700.
10. Каково назначение дифракционной решетки в спектральном приборе.
11. Приведите основной закон, используемый для количественного анализа в ИК – спектроскопии.
12. Объясните природу нормальных колебаний и групповых частот, их количество и активность в ИК – спектрах.