Тема 4.1. Применение газовой хроматографии для определения активности каталазы. Полученные данные оформляют в соответствующие таблицы, статистически обрабатывают и обсуждают

С необходимостью разделения смеси веществ на составляющие ее компоненты приходится сталкиваться как химику-синтетику, химику-аналитику, так и технологу, геологу, физику, биологу и многим другим специалистам. Особое значение разделение смесей веществ имеет в последние десятилетия в связи с проблемой получения сверхчистых веществ. Хроматографические методы анализа помогают облегчить работу во многих областях науки и существенно повысить качество проводимых анализов. В последнее время хроматография широко используется и как метод научного исследования, например, для изучения свойств сложных смесей веществ, в частности растворов.

Принципиальным отличием хроматографических методов от других физико-химических методов анализа является возможность разделения близких по свойствам веществ. После разделения компоненты анализируемой смеси можно идентифицировать (установить природу) и количественно определять (массу, концентрацию) любыми химическими, физическими и физико-химическими методами. Широкое распространение хроматографические методы получили благодаря своим достоинствам: эффективности, простоте эксперимента, селективности, быстроте, возможности автоматизации в сочетании с другими физико-химическими методами. Отличительная особенность хроматографических методов – их универсальность, т.е. возможность использования для разделения и определения твердых, жидких и газообразных неорганических и органических соединений в широком интервале концентраций.

Ценность хроматографических методов состоит в том, что они позволяют эффективно проводить разделение соединений с близкими свойствами. Хроматография дает возможность проводить качественный и количественный анализ исследуемых объектов, изучать физико-химические свойства веществ, осуществлять контроль и автоматическое регулирование технологических процессов. В последнее время хроматография – один из основных методов контроля окружающей среды. Хроматографические методы разделения веществ основаны на сорбционных процессах. Под сорбцией понимают поглощение газов, паров или растворенных веществ сорбентами - твердыми или жидкими поглотителями. Сорбция – общее понятие, которое включает в себя адсорбцию (поглощение на поверхности фазы) и абсорбцию (поглощение в объеме фазы).

Сущность всех хроматографических методов состоит в том, что разделяемые вещества перемещаются через слой неподвижного сорбента (неподвижной фазы) вместе с подвижной фазой (жидкой или газообразной) с разной скоростью благодаря их различной сорбционной способности. В процессе хроматографирования много раз повторяются процессы сорбции и десорбции компонентов в новых слоях сорбента, что обеспечивает высокую эффективность разделения.

Таким образом, хроматография – это динамический сорбционный способ разделения смесей, основанный на распределении вещества между двумя фазами, одна из которых подвижна, а другая – неподвижна, и связанный с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов.

Хроматография (от греч. chroma, chromatos - цвет, краска), физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную. Хроматографический анализ является критерием однородности вещества: если каким-либо хроматографическим способом анализируемое вещество не разделилось, то его считают однородным (без примесей).

Принципиальным отличием хроматографических методов от других физико-химических методов анализа является возможность разделения близких по свойствам веществ. После разделения компоненты анализируемой смеси можно идентифицировать (установить природу) и количественно определять (массу, концентрацию) любыми химическими, физическими и физико-химическими методами.

История метода:
Хроматографический метод анализа был впервые применён русским учёным-ботаником Михаилом Семеновичем Цветом в 1900 году. Он использовал колонку, заполненную карбонатом кальция для разделения пигментов растительного происхождения. Первое сообщение о разработке метода хроматографии было сделано Цветом 30 декабря 1901 года на XI Съезде естествоиспытателей и врачей в С.-Петербурге. Первая печатная работа по хроматографии была опубликована в 1903 году, в журнале Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Впервые термин хроматография появился в двух печатных работах Цвета в 1906 году, опубликованных в немецком журнале Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft. В 1907 году Цвет демонстрирует Немецкому Ботаническому обществу образец хроматографа — прибора для осуществления процесса хроматографии. В 1910-1930 годы метод был незаслуженно забыт и практически не развивался. В 1952 году Дж. Мартину и Р. Синджу была присуждена Нобелевская премия по химии за создание метода распределительной хроматографии. С середины 20 века и до наших дней хроматография интенсивно развивалась и стала одним из наиболее широко применяемых методов анализа.

Хроматография широко применяется в лабораториях и в промышленности для качественного и количественного анализа многокомпонентных систем, контроля производства, особенно в связи с автоматизацией многих процессов, а также для препаративного (в т. ч. промышленного) выделения индивидуальных веществ (например, благородных металлов), разделения редких и рассеянных элементов.

В некоторых случаях для идентификации веществ используется хроматография в сочетании с другими физико-химическими и физическими методами, например с масс-спектрометрией, ИК-, УФ-спектроскопией и др. Для расшифровки хроматограмм и выбора условий опыта применяют ЭВМ.

Основные достоинства хроматографического анализа:

• экспрессность; высокая эффективность; возможность автоматизации и получение объективной информации;
• сочетание с другими физико-химическими методами;
• широкий интервал концентраций соединений;
• возможность изучения физико-химических свойств соединений;
• осуществление проведения качественного и количественного анализа;
• применение для контроля и автоматического регулирования технологических процессов.

В зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой, различают следующие основные виды хроматографии - адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную (молекулярно-ситовую) и осадочную.

Адсорбционная хроматография основана на различии сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом (твёрдое тело с развитой поверхностью); распределительная хроматография - на разной растворимости компонентов смеси в неподвижной фазе (высококипящая жидкость, нанесённая на твёрдый макропористый носитель) и элюенте; ионообменная хроматография - на различии констант ионообменного равновесия между неподвижной фазой (ионитом) и компонентами разделяемой смеси; эксклюзионная (молекулярно-ситовая) хроматография - на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель). Осадочная хроматография основана на различной способности разделяемых компонентов выпадать в осадок на твёрдой неподвижной фазе.

В соответствии с агрегатным состоянием элюента различают:

• газовую хроматографию ГХ (GC)
• жидкостную хроматографию ВЭЖХ (HPLC).

Газовая хроматография применяется для газов разделения, определения примесей вредных веществ в воздухе, воде, почве, промышленных продуктах; определения состава продуктов основного органического и нефтехимического синтеза, выхлопных газов, лекарственных препаратов, а также в криминалистике и т.д.

Принципиальная схема газового хроматографа

В аналитических хроматографах используют проявительный вариант хроматографии, в этом случае газ-носитель непрерывно продувается через хроматографическую колонку. Расход газа-носителя создается за счет перепада давления на входе и выходе колонки. Схема современного газового хроматографа изображена на рисунке. Для создания перепада давления через колонку хроматограф подсоединяют к источнику со сжатым газом 1. Это может быть баллон или лабораторная линия со сжатым газом. Через колонку поток газа-носителя должен проходить с постоянной и определенной скоростью. Поэтому на входе в колонку на линии газа-носителя устанавливают регулятор и стабилизатор расхода газа-носителя 2 и измеритель расхода газа 3. Если газ-носитель загрязнен нежелательными примесями, то в этом случае устанавливается еще фильтр 4.

Таким образом, на входе в колонку подключается ряд устройств, часто объединяемых в один блок (блок подготовки газа). Назначение этого блока - установка, стабилизация, измерение и очистка потока газа-носителя. Перед входом в колонку устанавливают устройство для ввода анализируемой пробы в колонку - дозатор-испаритель 5. Обычно анализируемую пробу вводят микрошприцем 8 через термостойкое резиновое уплотнение в дозаторе. Газовые пробы вводят дозирующим краном.

Анализируемая проба, введенная в дозатор, захватывается потоком газа-носителя и направляется в хроматографическую колонку 6. Если анализируемая проба - жидкость, то она предварительно переходит в дозаторе-испарителе в парообразное состояние. За счет различной способности к сорбции компоненты смеси будут с разной скоростью продвигаться по колонке. Вещества, которые сорбируются слабо, будут продвигаться по колонке с большей скоростью и выходить первыми. Вещества с большой сорбцией будут продвигаться по колонке медленнее. Если выбран селективный сорбент и подобраны оптимальные условия, то на выходе колонки компоненты смеси будут полностью разделены. Детектор 11 зарегистрирует присутствие разделенных компонентов в газе-носителе. Эти сигналы в случае необходимости усиливаются (усилитель 13) и регистрируются на шкале вторичного самопишущего прибора 14 или на мониторе компьютера в виде выходных кривых с пиками. Для обеспечения стабильного режима работы детектора используют блок питания детектора 12.

Сорбционная способность веществ зависит от температуры. Для исключения влияния колебания температуры на результаты разделения, колонку помещают в специальную камеру-термостат, температура которой устанавливается и поддерживается терморегулятором 9. В случае необходимости температура колонки в процессе разделения может изменяться по определенной программе с помощью блока программирования температуры 10. Высота или площадь пика пропорциональны количеству или концентрации компонента в смеси. Площадь пика может быть измерена с помощью электронного интегратора 15 или любого другого устройства с теми же функциями. Значения площадей пиков могут быть распечатаны с помощью принтера.

Таким образом, перед хроматографическим анализом необходимо провести следующие операции на приборе:

открыть вентиль баллона со сжатым газом и установить по манометру или специальному измерителю определенный расход газа-носителя;

включить питание детектора;

установить необходимую температуру в термостате колонок;

включить самопишущий прибор, интегратор или компьютер;

после выхода прибора на устойчивый режим (через 30–60 мин.) микрошприцем отобрать и ввести в дозатор-испаритель анализируемую пробу.

Все дальнейшие операции проходят без участия оператора: компоненты пробы разделяются на колонке, регистрируются в детекторе, записываются, рассчитываются площади пиков. В случае применения компьютера с принтером можно сразу получить полный протокол - хроматограмму с распечатанной рядом таблицей концентраций разделенных компонентов.

Основные узлы приборов для хроматографического анализа

Независимо от сложности устройства основными узлами хроматографической установки являются:

устройство для ввода проб с дозатором,

хроматографическая колонка, помещенная в термостат,

детектор.

Устройство для ввода проб в хроматограф представляет собой стальной цилиндр с каналом, закрытым резиновой прокладкой. Анализируемую пробу вводят в прибор с помощью микрошприца, протыкая иглой слой резины (рис.4.5.)

Дозатор – устройство для точного количественного отбора пробы и введения её в хроматографическую колонку. Основные требования к дозатору:

воспроизводимость размера пробы;

постоянство условий введения пробы в колонку;

введение пробы не должно вызывать резкого изменения условий работы колонки и других узлов хроматографа;

поверхность дозатора не должна обладать адсорбционной и каталитической активностью по отношению к анализируемой смеси.

Устройство нагревают с помощью электрической спирали, чтобы проба после введения в хроматограф мгновенно испарялась. Пары, подхваченные газом-носителем, начинают свое движение по колонке. После извлечения иглы резина «самоуплотняется», сохраняя тем самым герметичность прибора. Газовые пробы вводят с помощью другого устройства, представляющего собой двойной кран с трубкой дозатором определенного объема. Краны могут быть 6, 8, 10 и даже 14-ходовые. Сначала при одном положении крана через трубку продувают в атмосферу анализируемую газовую смесь. Затем поворотом крана перекрывают концы трубки-дозатора и дальнейшим поворотом вводят её в поток газа-носителя.

Детекторы

Детектор – прибор, предназначенный для обнаружения изменений в составе газа-носителя, прошедшего через колонку. Показания детектора преобразуются в электрический сигнал и передаются фиксирующему или записывающему устройству, например, компьютеру. Основные характеристики детектора: чувствительность; пределы детектирования; инерционность; диапазон линейной зависимости между концентрацией и величиной сигнала. По форме зарегистрированного сигнала детекторы подразделяют на детекторы дифференциальные и интегральные. Дифференциальные детекторы измеряют мгновенное различие в концентрации вещества в потоке газа-носителя.

Хроматограмма, зарегистрированная таким детектором, представляет собой ряд пиков, площадь которых пропорциональна количеству разделенных соединений. Интегральные детекторы измеряют суммарные количества соединений, выходящих из колонки. Хроматограмма в этом случае ступенчатая, высота ступеней пропорциональна количеству соответствующих соединений. Основные технические характеристики детекторов: чувствительность или предел детектирования; линейность (динамический диапазон); инерционность (постоянная времени, быстродействие); стабильность (уровень шума и дрейфа); величина эффективного объема чувствительной ячейки.

Виды детекторов в газовой хроматографии определяются измеряемой ими величиной:

катарометр (теплопроводность газа-носителя);

термохимические детекторы (температура газа-носителя);

пламенные детекторы (температура пламени при введении органических веществ);

пламенно-ионизационные детекторы ПИД (электропроводность пламени);

пламенно-фотометрические детекторы.

Современные газовые хроматографы и области их использования

Газовый хроматограф НР 4890D (рис.4.17.) оснащен детекторами ионизации пламени и электронного захвата. Основные характеристики детекторов приведены в таблице 4.1. С помощью этого хроматографа можно проводить определение летучих примесей (спиртов, эфиров, органических кислот, альдегидов, кетонов, предельных и ароматических углеводородов, галогенсодержащих соединений), а также некоторых нелетучих соединений (лимонной, винной, молочной, пировиноградной кислот) в различных объектах.

Хроматограмма газо-воздушных выбросов в атмосферу, полученных на этом хроматографе, приведена на рис.4.18.

Применение газовой хроматографии

Метод газовой хроматографии — один из самых современных методов многокомпонентного анализа. Его отличительные черты — экспрессность, высокая точность, чувствительность, автоматизация. Целью применения газовой хроматографии может быть качественный и количественный анализы смеси, препаративное выделение веществ, а также определение физико-химических характеристик. Возможность анализа малых количеств вещества и малых его концентраций обусловливает применение метода в биологии, медицине, физической химии, геохимии, космохимии, криминалистике и других отраслях:

Метод эффективен при анализе веществ, относящихся к одному и тому же классу (углеводороды, органические кислоты, спирты и т.д.).

Метод незаменим в нефтехимии (бензины содержат сотни соединений, а керосины и масла — тысячи).

Используют при определении пестицидов, удобрений, лекарственных препаратов, витаминов, наркотиков.

Можно определять металлы, переводя их в летучие соединения – хелаты.

Используют в препаративных целях для очистки химических препаратов, выделения индивидуальных веществ из смесей.

Широко применяют в физико-химических исследованиях: для определения свойств адсорбентов, термодинамических характеристик адсорбции и теплот адсорбции, величин поверхности твердых тел, а также констант равновесия, коэффициентов активности и др.

Жидкостная хроматография используется для анализа, разделения и очистки синтетических полимеров, лекарственных препаратов, детергентов, белков, гормонов и др. биологически важных соединений. Использование высокочувствительных детекторов позволяет работать с очень малыми количествами веществ (10^-11-10^-9 г), что исключительно важно в биологических исследованиях.

В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы газовая хроматография ГХ (GC) бывает газо-адсорбционной (неподвижная фаза - твёрдый адсорбент) и газожидкостной (неподвижная фаза - жидкость), а жидкостная хроматография - жидкостно-адсорбционной (или твёрдо-жидкостной) и жидкостно-жидкостной.

Различают колоночную и плоскостную хроматографию. В колоночной сорбентом заполняют специальные трубки - колонки, а подвижная фаза движется внутри колонки благодаря перепаду давления. Разновидность колоночной хроматографии - капиллярная, когда тонкий слой сорбента наносится на внутренние стенки капиллярной трубки. Плоскостная хроматография подразделяется на тонкослойную и бумажную. В тонкослойной хроматографии тонкий слой гранулированного сорбента или пористая плёнка наносится на стеклянную или металлическую пластинки; в случае бумажной хроматографии используют специальную хроматографическую бумагу. Тонкослойная (ТСХ) и бумажная хроматография используются для анализа жиров, углеводов, белков и др. природных веществ и неорганических соединений.

Ряд видов хроматографии осуществляется с помощью приборов, называемых хроматографами, в большинстве из которых реализуется проявительный вариант хроматографии. Хроматографы используют для анализа и для препаративного (в т. ч. промышленного) разделения смесей веществ. При анализе разделённые в хроматографической колонке вещества вместе с элюентом попадают в установленное на выходе из колонки специальное устройство – детектор, регистрирующее их концентрации во времени.

Полученную в результате этого выходную кривую называют хроматограммой. Для качественного хроматографического анализа определяют время от момента ввода пробы до выхода каждого компонента из колонки при данной температуре и при использовании определённого элюента. Для количественного анализа определяют высоты или площади хроматографических пиков с учётом коэффициентов чувствительности используемого детектирующего устройства к анализируемым веществам.

В соответствии с природой детектора и механизмом возникновения сигнала различают химические, физические, физико-химические, биологические и др. (см.табл.).

Подвижные, неподвижные фазы и детекторы различных хроматографических методов анализа

(по материалам "евролаб")

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА

Хроматографическим называется процесс разделения веществ, основанный на различии в их сорбции, осуществляемый при перемещении их по сорбенту и связанный с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов. Сорбция - поглощение веществ твердым телом или жидкостью. В зависимости от природы сорбционных процессов их подразделяют на адсорбцию и абсорбцию.

Адсорбция осуществляется поверхностью твердого тела или жидкости под действием поверхностных сил. Используемые в газовой хроматографии адсорбенты представляют собой пористые вещества с большой удельной поверхностью. Абсорбция представляет собой избирательное поглощение газа всем объемом жидкости или твердого тела. В зависимости от химической структуры анализируемых веществ и свойств сорбента абсорбционные силы, определяющие их взаимодействие, имеют различную природу (дисперсионные, ориентационные и специфические взаимодействия).

В газовой хроматографии подвижной фазой является газ, а сорбентом служит твердое вещество (газоадсорбционный вариант) или пленка жидкости, нанесенная на твердый сорбент (газожидкостный вариант). Каждый из этих вариантов газовой хроматографии имеет свои преимущества и недостатки, поэтохму выбор наиболее эффективного способа анализа определяется конкретной задачей исследования. Использование жидкостей самой различной химической природы в качестве неподвижной жидкой фазы сделало га- зо-жидкостную хроматографию универсальным методом разделения газообразных веществ на основе физико-химических взаимодействий.

Сорбентами в газоадсорбционной хроматографии служат разнообразные минеральные и полимерные материалы, к которым предъявляются следующие требования: устойчивость к механическому разрушению, химическая инертность, большая удельная поверхность и сферическая форма частиц. Сорбентом в газожидкостной хроматографии служат различные органические, кремнийор- ганические и минеральные жидкости, наносимые на твердый носитель. Степень пропитки носителя неподвижной жидкой фазой выражается в процентах к его массе. В качестве подвижной фазы, необходимой для перемещения компонентов анализируемой газовой пробы по слою сорбента, в газовой хроматографии используют следующие газы-носители: гелий, водород, азот, аргон, углекислый газ или воздух.

В настоящее время с помощью газовой хроматографии можно осуществлять идентификацию и количественное определение компонентов смесей органических и неорганических газов, а также жидкостей и твердых тел, давление пара которых превышает 0,11- 113 Па (0,001-1 мм рт. ст.), т.е. перегоняющихся без разложения при нагреве до 400-500 °С. Можно анализировать и нелетучие соединения, для которых отработана методика воспроизводимого разложения, или соединения, превращаемые в результате химических реакций в летучие производные.

Газовая хроматография дает возможность разделения и количественного анализа гаммовых (миллионных долей грамма) количеств компонентов смесей, не поддающихся исследованию никакими другими известными физико-химическими методами. Скорость анализа достаточно высокая - цикл хроматографического разделения длится минуты или даже секунды.

Принципиальная схема газохроматографического анализа такова: через хроматографическую колонку, содержащую сорбент, пропускают газ-носитель, в который у входа в колонку вводят небольшую порцию анализируемой смеси, и ее компоненты группируются в зонах, отделенных друг от друга газом-носителем. Формирование зон проявляемых компонентов наблюдается на всем пути следования смеси в колонке. Вследствие имеющих место в обеих фазах диффузионных процессов максимальная концентрация каждого компонента оказывается в центре зон. Если на выходе колонки регистрировать изменение с течением времени какого-либо физического свойства газового потока (так называемое дифференциальное детектирование), то хроматографическая кривая (хроматограмма) предстанет в виде острых пиков над нулевой (базовой) линией.

УСТРОЙСТВО ГАЗОВОГО ХРОМАТОГРАФА

Газовый хроматограф представляет собой физический аналитический прибор. Он состоит из нескольких функциональных блоков, предназначенных для проведения качественного и количественного анализа газов, который начинается вводом пробы и заканчивается регистрацией определяемых компонентов.

В настоящее время газовые хроматографы для анализа всевозможных газообразных соединений комплектуются следующими блоками (рис):

1) блок подготовки газов;

2) блок ввода анализируемой пробы (испаритель);

3) хроматографические колонки;

4) детектор;

5) электронный усилитель;

6) регистратор.

БЛОК ПОДГОТОВКИ ГАЗОВ

Предназначен для очистки, установки, стабилизации и измерения скорости газа-носителя и газов, необходимых для работы ионизационных детекторов. Газовые потоки очищают от пыли, влаги и органических соединений с помощью фильтров, заполненных активными адсорбентами (силикагелем, активированным углем, молекулярными ситами). Чистота газов особенно важна при работе с высокочувствительными детекторами, где примеси являются источником повышенного фонового сигнала. Точная установка расхода газа-носителя и его стабилизация непосредственно влияют на время выхода и форму пиков анализируемых газов. Кроме того, нестабильность газовых потоков часто служит причиной дрейфа нулевой линии, что затрудняет количественную обработку результатов.

Скорость потоков измеряют с помощью реометров, ротаметров и мыльно-пенных измерителей (рис). Наиболее высокая точность определения малых расходов обеспечивается пенным измерителем, который присоединяют к выходу газового потока. С помощью секундомера определяют время, за которое пленка мыльной пены проходит калиброванный объем бюретки, и рассчитывают скорость газового потока (мл/мин). Однако пенный измеритель не может быть встроен в хроматограф и обеспечивает лишь периодическое измерение расхода газа на выходе из колонки или детектора при максимальном расходе до 100 мл/мин. Для измерения больших скоростей потока газа используются ротаметры, представляющие собор! конические калиброванные трубки, в которых уровень поднятия поплавка зависит от скорости газа.

Часто расход газа, проходящего через колонку, определяется косвенным путем по величине давления на входе хроматографи- ческой колонки, которое измеряют манометром соответствующего класса. Манометр может быть прокалиброван таким образом, что на нем указаны значения расхода газа. В поток газа-носителя непосредственно перед входом в колонку вводится определенное количество анализируемой смеси в газообразном или жидком состоянии. Для введения газовых и жидких проб в колонку служит испаритель - нагреваемый до определенной температуры металлический блок (рис. 3) с каналом для ввода и испарения пробы. В канал подается газ-носитель. С одной стороны, канал закрыт мембраной из термостойкой эластичной резины, с другой - к нему присоединена хроматографическая колонка.

Анализируемая газовая проба вводится шприцем через резиновую мембрану или с помощью крана-дозатора непосредственно в колонку. Для эффективного разделения газов очень важно, чтобы введенная проба попала в колонку без разбавления в испарителе, так как разбавленная проба вымывается значительно дольше, что вызывает значительное уширение пиков на хро- матограмме. Поток газа-носителя в испарителе вносит анализируемую пробу в колонку, где осуществляется разделение смеси на компоненты.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ КОЛОНКИ

Используемые для аналитических работ хроматографические колонки подразделяются на три основных типа: насадочные (набивные), микронасадочные и капиллярные. Насадочные колонки — это разделительные устройства, внутренняя полость которых заполняется инертным твердым носителем, покрытым тонкой пленкой жидкой фазы, или активным адсорбентом. Наполнитель на- садочных и микронасадочных колонок называется насадкой или сорбентом. Насадочные колонки получили наибольшее распространение в связи с простотой приготовления для них необходимых сорбентов и заполнения ими колонок. Кроме того, для работы с этими колонками используются детекторы средней чувствительности. Насадочные колонки изготовляются из стальных (нержавеющая сталь), стеклянных или полимерных трубок с внутренним диаметром 2-6 мм и длиной 0,2-3 м, которым придается спиральная или U-образная форма (рис.).

Микронасад очные колонки отличаются от насадочных только диаметром трубок, составляющих 0,8-1,0 мм. Длина таких колонок обычно не превышает 2 м. Форма насадочных и микронасадоч- ных колонок практически не влияет на эффективность разделения и определяется главным образом размерами термостата. Однако в прямых и U-образных колонках легче достигается равномерное заполнение сорбентом. В настоящее время хроматографы комплектуются колонками из стекла и нержавеющей стали, антикоррозийные свойства которых допускают длительную эксплуатацию без специальной обработки и очистки.

Капиллярные колонки изготавливают из капиллярных трубок, материалом для которых служит нержавеющая сталь, медь или стекло. Внутренний диаметр таких колонок 0,25-0,5 мм, длина 10-200 м. Капиллярные колонки отличаются от насадочных и микронасадочных тем, что жидкая фаза или слой адсорбента не заполняют всю полость, а покрывают тонким слоем лишь внутреннюю поверхность колонки. Капиллярная трубка после внесения сорбента остается, таким образом, полой. Поток газа движется по такой колонке с большой линейной скоростью, не встречая значительного сопротивления. Поэтому, несмотря на большую длину, для обеспечения необходимого расхода газа-носителя, проходящего в капиллярную колонку, нужно такое же входное давление, что и при работе с насадочными колонками.

Хроматографическая колонка является аналитическим инструментом, в котором разделяются два или больше компонентов. Разделительная способность (разрешение) колонки зависит от ее селективности и эффективности. Селективность колонки характеризуется расположением максимумов двух разделяемых компонентов: чем больше расстояние между ними, тем более селективна колонка. Селективность можно выразить отношением времени удержания второго компонента к времени удержания первого. Время удержания — разница между временем регистрации максимума пика и ввода пробы в колонку. Эффективность колонки является мерой размывания хроматографических зон анализируемых соединений в процессе разделения, характеризуется шириной основания пика анализируемого компонента.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ ПО КОЛИЧЕСТВУ ВЫДЕЛЯЮЩЕГОСЯ КИСЛОРОДА

Назначение.

Определение скорости распада перекиси водорода при взаимодействии катал азы с почвой. Принцип метода. Каталаза (Н202:Н202 — оксидоредуктаза. КФ 1.11.1.6) катализирует реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород: Н202 + Н202 Каталаза) 02 +2 Н20.

Газохроматографический метод определения активности ката- лазы в почве основан на учете количества кислорода, образующегося при разложении перекиси водорода. Реактивы и газы. Наполнитель для колонки: молекулярные сита СаА, газ-носитель — гелий или водород в баллонах, внутренний стандарт неон в баллончике.

Приготовление стандарта: в качестве стандарта для градуировки хроматографа используется воздух, в котором содержится 21% кислорода. В 1 мл 100%-ного 02 содержится 1,43 мг 02:32 (молекулярная масса)/22,4 (число Авогадро). В воздухе содержится 21% 02, т.е. во вводимой в хроматограф пробе стандарта (0,5 мл воздуха) будет содержаться 0,15 мг 02. Константа хроматографа (К) находится как отношение содержания кислорода во вводимой пробе (0,15 мг) к величине пика стандарта (X, мм): К = 0,15/Х (мг 02/1 мм пика).

Для стандартизации условий хроматографирования и повышения точности определения используется внутренний стандарт — неон.

Приборы и посуда.

Газовый хроматограф с детектором теплопроводности (ДТП), термостат биологический, сушильный шкаф, весы ВЛКТ, шприцы медицинские на 1 мл, инкубационные сосудики на 40 мл с пробками от пенициллиновых пузырьков и пластмассовыми завинчивающимися крышками с отверстиями, чашка фарфоровая или алюминиевая диаметром 12 см, промывалка, бюксы алюминиевые, резиновая груша, буры агрохимический и почвенный.

Методика определения.

Навеску свежей почвы 10 г помещают в инкубационные сосудики объемом 40 мл, закрывают резино-выми пробками, завинчивают пластмассовыми крышками с отверстиями для взятия проб. Определение проводят на большом фоне атмосферного кислорода, поэтому используют внутренний стандарт неон или другой инертный газ, не вступающий ни в какие биохимические реакции. Медицинским шприцем на 1 мл в инкубационные сосудики вводят по 0,5 мл 100%-ного неона. Сосудики оставляют стоять при комнатной температуре 1 ч, периодически встряхивая для равномерного заполнения неоном порового пространства почвенной пробы.

Через час определяют на газовом хроматографе содержание кислорода и неона. Медицинским шприцем вносят в инкубационные сосудики 5 мл 0,3%-ного раствора перекиси водорода, инкубируют в термостате при 4-28 °С в течение 30 мин. В качестве контроля ставят инкубироваться образцы почвы, про- стерилизованные при 150 °С в течение одного часа. После инкубирования сосудики вынимают из термостата, охлаждают до комнатной температуры и анализируют на содержание неона и кислорода. Точность определения кислорода контролируется величиной пика неона. За исходные значения принимаются пики кислорода и неона, измеренные перед компостированием. Пик кислорода, определяемый после компостирования, корректируется по пикам неона, полученным до и после компостирования.

Если пики неона до и после компостирования равны, то пики кислорода сравнимы; если не равны, то при меньшем пике неона после компостирования поправка к пику кислорода будет больше 1 и вычисляется как отношение пиков неона до и после компостирования. Если пик неона после компостирования больше, чем до компостирования, то величина пика кислорода умножается на коэффициент меньше 1, который вычисляется как отношение пиков неона до и после компостирования.

Условия хроматографирования. Детектор теплопроводности газов (ДТП), колонка— 1 м, наполнитель — молекулярные сита СаА, температура испарителя и термостата колонок —30 °С, газ- носитель — гелий или водород, расход газа-носителя — 20 мл/мин, время выхода пика неона— 10 с, кислорода — 20 с. Обработка результатов анализа. Активность каталазы вычисляют по формуле

где D — активность катал азы С02 (мг С02/(кг-сут)); h\ —величина пика 02 до компостирования (мм); Л2 — величина пика О2 после компостирования (мм); /?з — величина пика неона до компостирования (мм); Л-4 — величина пика неона после компостирования (мм); К — постоянная (мг 02/мм пика); 1,38 —коэффициент перехода от массы поглощенного кислорода к массе выделенного почвой СО2; VCB— объем газовой фазы в инкубационном сосудике (мл); 1000- граммов в 1 кг; 24 — часов в сутках; р — навеска почвы, помещенной в инкубационный сосудик (г); t — время инкубации.

Контрольные вопросы

1. В чем сущность методов хроматографии?
2. В чем сущность хроматографического разделения по методу: а) газоадсорбционной хроматографии; б) газожидкостной хроматографии; в) распределительной жидкостной хроматографии; г) осадочной хроматографии; д) тонкослойной хроматографии; е) ионообменной хроматографии?
3. Каковы области применения, достоинства и недостатки методов адсорбционной хроматографии?
4. Какие требования предъявляются к адсорбентам и растворителям (элюентам)? Назовите наиболее распространенные растворители и адсорбенты в жидкостной хроматографии.
5. Каковы области применения, достоинства и недостатки методов газовой хроматографии?
6. Какие устройства используют в качестве дозаторов?
7. Каков принцип работы дифференциальных детекторов: а) катарометра; б) термохимического; в) ионизационного (или пламенно-ионизационного); г) селективного (термоионного)?
8. Какие требования предъявляются к жидкой фазе в газо-жидкостной хроматографии? Какие вещества используют в качестве жидкой фазы, в качестве твердого носителя? Какие хроматографические колонки применяют для анализа?
9. Дать определения следующих понятий: а) высота хроматографического пика; б) ширина хроматографического пика; в) приведенный удерживаемый объем; г) общий удерживаемый объем.
10. Что такое коэффициент селективности работы колонки? Каково условие количественного разделения двух компонентов смеси?
11. В чем сущность качественного хроматографического анализа по величине удерживаемого объема?
12. В чем сущность методов количественного анализа: а) абсолютной калибровки; б) внутренней нормализации; в) внутреннего стандарта?
13. В чем сущность ионообменной хроматографии?
14. Какие виды жидкостной хроматографии существуют в зависимости от механизма удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой ЖХ?
15. Какие виды хроматографии существуют в зависимости от способа перемещения вещества?
16. Какие вещества используют в качестве адсорбентов? Чем они отличаются?
17. Что служит жидкой подвижной фазой- элюентом? Требования к растворителям.
18. В чем отличие распределительной хроматографии от адсорбционной хроматографии?
19. Перечислите основные части схемы жидкостного хроматографа, их назначение.