Для реакции используют гель, приготовленный из агара Дифко или же специально приготовленный предельно осветленный гель из агар–агара.

Сущность реакции заключается в том, что специфические Ат и АГ диффундируют в гель, взаимодействуя между собой, и образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитата. Радиальная иммунодиффузия в геле может быть простой и двойной.

Иммунодиффузия по Оухтерлони

В агаре, разлитом тонким слоем в чашки или же на предметное стекло, вырезают лунки на равном расстоянии друг от друга ( 4 – 10 мм ) при помощи специальных штампов или стеклянных трубок с ровными краями. В лунки вносят раствор сыворотки или раствор антигена в различных разведениях. Из лунок АГ и АТ диффундируют навстречу друг другу и образуют преципитат в виде тонких белесоватых линий.

Поскольку диффузия реагентов из лунок в гель происходит радиально, это позволяет анализировать сразу несколько образцов иммунореагентов, разместив вокруг лунки с антисывороткой несколько лунок с растворами разных антигенов; или наоборот, заполняя периферические лунки антисывороткой, а центральную искомым антигеном; или в центральную лунку внести известный АГ, а в периферические – исследуемую сыворотку в разных разведениях.

Метод двойной иммунодиффузии применяют преимущественно для качественного анализа, для определения природы АГ и АТ, но можно использовать и для полуколичественного определения АГ и АТ путем их титрования.

Для количественного определения антигена часто используют простую радиальную иммунодиффузию по Манчини, которая основана на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении раствора исследуемого АГ в лунки, вырезанные в слое геля, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка.

В стандартных условиях опыта диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого АГ. Содержание АГ определяют относительно стандартного раствора АГ с известной его концентрацией. Чаще всего при помощи этого метода определяют белковые АГ: количество Yg разных классов в сыворотке крови и других жидкостях, секретов желез, белков крови, спинномозговой жидкости и т.д.

Реакцию иммунодиффузии обычно поводят при комнатной температуре, во влажных камерах. Продолжительность иммунодиффузии зависит от природы АГ.

Методы иммунодиффузии обладают высокой специфичностью и чувствительностью.

Реакция флокуляции – вид иммунопреципитации, при котором преципитат представляет собой хлопьевидную массу. Реакцию проводят смешиванием разных разведений сыворотки со стандартным количеством раствора АГ в объеме 2 мл.

Первая пробирка, где появились хлопья ( инициальная флоккуляция ) указывает на эквивалентное соотношение АГи АТ. По инициальной флоккуляции рассчитывают количество сыворотки или АГ, исходя из активности взятых в опыт стандартных препаратов. Применяется для определения токсинов микроорганизмов в исследуемом материале.

1.3. ИММУНОМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунологические методы применяют для решения многих задач:

1. Оценка состояния иммунной системы человека (иммунного статуса) по определению количественных и функциональных характеристик клеток иммунной системы и их продуктов.
2. Определение состава и характеристик тканей человека: групп крови, резус фактора, трансплантационных антигенов.
3. Диагностика инфекционных болезней и резистентности к ним по обнаружению и установлению титров антител (серодиагностика), выявлению антигенов возбудителей в организме, определению клеточных реакций на эти антигены.
4. Сероидентификация культур бактерий и вирусов, выделенных из организма человека и животных.
5. Выявление в организме человека и во внешней среде любых веществ, обладающих антигенными или гаптенными свойствами (гормоны, ферменты, яды, лекарства, наркотики и т.п.).
6. Выявление иммунопатологических состояний, аллергий, трансплантационных и противоопухолевых реакций.

В основе иммунологических методов лежат серологические реакции, для постановки которых используют сыворотку (serum), содержащую антитела (основаны на взаимодействии антигенов и антител) и клеточные реакции, базирующиеся на взаимодействии антигенов (аллергенов) с Т–клетками.

Иммуномикробиологические исследования – вид микробиологического экспресс–анализа по выявлению специфических антител и антигенов.

Процесс взаимодействия антигена и антитела в серологических реакциях протекает в две фазы:

1. специфическая – фаза взаимодействия, в которой происходит комплементарное соединение активных центров антител (паратопов) и эпитопов антигена. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут;
2. неспецифическая – фаза проявления, характеризуется внешними признаками образования иммунных комплексов. Эта фаза может развиваться от нескольких минут до нескольких часов.

Оптимальное специфическое взаимодействие антител с антигеном происходит в изотоническом растворе с рН, близким к нейтральному. Реакция антиген–антитело в системе in vitro может сопровождаться возникновением нескольких феноменов – агглютинации, преципитации, лизиса. Внешние проявления реакции зависят от физико–химических свойств антигена (размер частиц, физическое состояние), класса и вида антител (полные и неполные), а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, рН, температура).

Поливалентность антигенов и антител обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это происходит в соответствии с теорией образования сетей, согласно которой к образовавшемуся комплексу антиген–антитело последовательно присоединяются другие молекулы антител и антигена. В результате формируются сетевые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок. Характер и выраженность реакции зависят от количественного соотношения антигенов и антител. Наиболее интенсивно реакции проявляются в том случае, если реагенты находятся в эквивалентном соотношении.

Необходимое условие образование решетки (сетей) – наличие более трех антигенных детерминант на каждую молекулу антигена и по два активных центра на каждую молекулу антитела. Молекулы антигена являются узлами решетки, а молекулы антител – связующими звеньями. Область оптимальных соотношений (зона эквивалентности) концентраций антигена и антител, когда в надосадочной жидкости после образования осадка не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела.

Агрегаты, способные выпадать в осадок, образуются при соединении антигенов с полными антителами. Неполные антитела (моновалентные) не вызывают образования сетевых структур и крупных агрегатов. Для выявления таких антител используют специальные методы, основанные на использовании антиглобулинов (реакция Кумбса).

Серологические реакции, благодаря высокой специфичности и чувствительности, применяют для выявления и количественного определения антигенов и антител. Количество иммунореагентов в реакциях выражают титром – максимальным разведением сыворотки или антигена, при котором еще наблюдается реакция.

Серологические реакции в микробиологических и иммунологических лабораториях используют в двух целях:

1. для сероидентификации микроорганизмов, токсинов, антигена вообще с помощью известного антитела (иммунной диагностической сыворотки),
2. для серодиагностики – определения природы антитела в сыворотке крови больного при бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваниях с помощью известного антигена (диагностикума).

Для определения родовой, видовой и типовой принадлежности антигена необходимы заведомо известные иммунные диагностические сыворотки. Их получают путем многократного введения животным (чаще кроликам) в нарастающих дозах убитых или живых микроорганизмов, продуктов их распада, обезвреженных или нативных токсинов. После определенного цикла иммунизации животных делают массивное кровопускание или тотальное обескровливание животного. Кровь, собранную в стерильную посуду, сначала помещают в термостат при температуре 37°С на 4 – 6 ч для ускорения свертывания, затем – в ледник на сутки. Полученную прозрачную сыворотку отсасывают в стерильную посуду, добавляют консерванты, определяют титр антител, проверяют на стерильность и разливают в ампулы.

Используются неадсорбированные и адсорбированные диагностические сыворотки. Неадсорбированные сыворотки обладают высокими титрами антител, но способны давать групповые (перекрестные) реакции. Адсорбированные сыворотки отличаются строгой специфичностью действия (реагируют только с гомологичным антигеном). Сыворотки, содержащие антитела только к одному определенному антигену называются монорецепторными.

Выпускают также сыворотки, меченные флюорохромами, ферментами, радиоизотопами, которые позволяют с высокой степенью точности обнаружить даже следы антигена.

В качестве антигенов (диагностикумы) в серологических реакциях применяют взвеси живых или убитых бактерий, продуктов их расщепления, токсины, вирусы. В ряде случаев используют экстракты или выделенные химическим путем антигены из микроорганизмов и тканей животных.

Все иммуномикробиологические методы можно разделить на 3 группы:

1. основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.);
2. основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латекс–агглютинации, угольной аггломерации, бентонит–агглютинации, связывания комплемента и др.);
3. с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы и другие методы).

К числу современных сложных методов иммунологической диагностики относят: иммуноферментный анализ, имммуносенсоры, методы генного зондирования, иммуноэлектрофорез и иммуноблоттинг.

Иммуноблотинг – один из современных высокоточных вариантов электрофореза с анализом разделенных белков иммунологическим методом. Тест осуществляется в три этапа: сначала проводится–электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия. Разделенные антигены переносятся за счет капиллярных сил или дополнительного электрофореза на иммобилизующую нитроцеллюлозную мембрану. Находящиеся на мембране антигены анализируются с помощью меченых ферментной или радиоактивной меткой антител (иммуноферментным или радиоиммунным методом).

Впервые принцип иммуносенсоров был использован М. Аizawа и соавт. (1977), когда они сконструировали мембрану, способную на иммунологический ответ. В настоящее время опубликовано несколько сообщений об использовании аналогичного подхода для определения различных микробных антигенов или антител к ним [Horbach Е. еt аl, 1989, Parry R. еt аl., 1990].

Принцип методов, основанных на иммуносенсорной технологии, заключается в изменении физико–химических свойств мембраны или другого носителя, связанного с антителами или антигенами. Уменьшение мембранного потенциала, изменение оптических или химических свойств среды, прилегающей к носителю, выявляются с помощью специального электрода или оптического устройства и выражаются в виде электрического сигнала.v

Существует два основных типа иммуносенсоров, различающихся по особенностям определения реакции антиген – антитело. 1 тип – так называемый немеченый иммуносенсор. Такое устройство состоит из металлического электрода для потенциометрии, покрытого полупроницаемой полимерной мембраной с иммобилизованными на ней молекулами антител (или антигена). В результате реакции с искомым комплементарным веществом образуются иммунные комплексы на поверхности мембраны.

Это приводит к изменению заряда мембраны и ее поверхностного потенциала. Изменение разности потенциалов и определяется электродом. 2 тип – меченый иммуносенсор. В этом случае на мембране также иммобилизуются антитела или антиген, но реакция определяется по изменению проводимости (амперметрия). Для этого используют кислородный электрод, реагирующий на изменение концентрации О2 после реакции антител с антигеном, меченым ферментом (например, каталазой). Конкуренция искомого антигена с известным количеством меченого конъюгата дает изменение проводимости раствора в области мембраны, что реализуется в виде электрического сигнала на выходе электрода.

В другой модификации результат цветной ферментативной реакции может быть определен и с помощью оптического устройства.

Для оценки результатов реакции в двух описанных типах иммуносенсоров значительно реже используют пьезоэлектрический эффект, измерение температурных колебаний и некоторые другие способы, менее разработанные в равнении с электрохимическими и оптическими.

Особенностью иммуносенсоров, отличающей их от других систем иммунохимической диагностики, является то, что информация о возникновении иммунного комплекса непосредственно реализуется в виде физического сигнала – изменения разницы потенциалов, оптической плотности, силы тока и т. п.

Одним из первых применений иммуносенсоров было измерение количества антител при сифилисе. Для этого на полупроницаемой мембране электрода связывали антигены трепонемы и инкубировали его в растворе сыворотки крови. Изменения разницы потенциалов наблюдали вплоть до разведения положительной контрольной сыворотки 1:800, причем, увеличение сигнала соответствовало повышению концентрации антител. Важно то, что после отмывания иммуносенсор можно использовать вновь. Аналогичный подход был применен для определения антител другой специфичности (к групповым антигенам крови) и альбумина.

Более сложное строение иммуносенсора увеличивает чувствительность анализа. Так при использовании меченого иммуносенсора достигается чувствительность до 0,1 нг белка/мл. Имеются данные об определении таким методом HBs– антигена с помощью I–электрода и антител к HBs–антигену, меченых пероксидазой. Устройство, включающее стеклянную матрицу, активированную различными вирусными антигенами (биочип) было использовано для серологической диагностики вирусных заболеваний. Предприняты попытки определять с помощью иммуносенсоров продукты синтеза некоторых грибов (охратоксин А), клетки С. Albicans. в настоящее время отсутствуют коммерческие образцы иммуносенсоров для диагностики инфекционных заболеваний, следует обратить внимание на основные этапы использования подобных устройств.

Опыт использования аналогичных систем для определения глюкозы в крови, гормонов, низкомолекулярных веществ позволяет разделить процесс анализа на три этапа:

1. подготовка образца для анализа. Некоторые типы иммуносенсоров способны взаимодействовать непосредственно с биологическим материалом. Однако чаще всего используется предварительно отделенная центрифугированием плазма или сыворотка крови, разведенная специальным раствором.
2. проведение аналитической процедуры. Помещая каплю раствора на микроэлектрод, или опуская электрод в исследуемый образец, создается контакт реагентов. Время достижения равновесия от нескольких секунд (для низкомолекулярных веществ) до нескольких минут (для высокомолекулярных агентов, антигенов, клеток). Результат определяется по разнице в показаниях с референс–электродом или по изменению сигнала после реакции. Результат может быть выражен в систематических единицах (милливольт, миллиампер), либо с помощью микропроцессора трансформирован в единицы концентрации искомого агента, в соответствии с предварительным калиброванием.
3. регенерация иммуносенсора. Для повторного или многократного использования иммуносенсора необходимо освободить его рабочую поверхность от веществ, активно или пассивно сорбированных в ходе анализа. Наиболее простой способ регенерации состоит в интенсивном последовательном промывании иммуносенсора раствором с кислым значением рН и буферным раствором с высокой ионной силой. Для некоторых типов иммуносенсоров до сих пор не найдено оптимальных условий регенерации, не снижающих их чувствительность. В этих случаях используют сменные одноразовые мембранные элементы. В ближайшее время будут созданы надежные портативные иммуносенсоры для диагностики наиболее распространенных инфекционных заболеваний, как это сделано уже для анализаторов глюкозы.