Бактерицидная активность сыворотки крови в зоогигиенических исследованиях определяется двумя путями.

Методика I в различных модификациях описана В.Ф. Матусевичем (964), В.В. Никольским 1968), И.Ф. Храбустовским (1974) и др. Она основана на вычислении разницы в количестве колоний тест-микробов, выросших при высевании до и после определенного периода инкубации сыворотки с микробной взвесью.

При проведении исследований указанным методом в качестве тест-микроба используют культуру кишечной палочки, паратифа и др. Исследования бактерицидной активности ведут на пластинке МПА в бактериальных чашках с определенной площадью, учитывается интенсивность и продолжительность роста культуры тест-микроба спустя 30 и 60 мин, 2, 3, 4, 24, 48 и 72 ч после контакта исследуемой сыворотки с тест-микробом. Для этого в стерильную пробирку берут 2 мл сыворотки, туда же вносят 0,05 мл суточной бульонной культуры тест-микроба, разведенной физиологическим раствором 1 : 1000. Контролем служит такая же пробирка с 2 мл физиологического раствора и 0,05 мл культуры. Из этих пробирок делают последовательно высевы через 30, 60 мин, 2, 3, 4, 24, 48 и 72 ч контакта исследуемой сыворотки с культурой тест-микроба.

Посевы делают в стерильных условиях, платиновой петлей с диаметром 2 мм на заранее приготовленный в пробирках (по 5 мл) стерильный агар. Последний перед каждым пересевом расплавляют, и после остывания до температуры 40┘45°С в одну пробирку высевают культуру с сывороткой, в другую - культуру с физиологическим раствором (контроль). Сразу после посева агар тщательно перемешивают с культурой, переливают в чашки Петри и ставят в термостат для инкубации при 37°С на 24 ч. Затем при помощи специальной сетки или счетчика микробных колоний подсчитывают число выросших колоний тест-микроба. Подсчет обычно ведется в 20 квадратах сетки. Определяется среднее количество колоний на площади 1 см² и на всей чашке.

Интенсивность бактерицидного действия сыворотки крови определяется путем вычисления процента колоний, прекративших свое развитие, по отношению к количеству их в момент контакта сыворотки с культурой (первый посев).

Методика II - фотонефелометрический метод, основанный на учете изменений оптической плотности среды, содержащей микробную взвесь и сыворотку крови.

Указанный метод состоит в следующем.

Сначала готовят суточную агаровую культуру тест-микроба (например, E. coli), затем ее смывают физиологическим раствором и полученную суспензию стандартизируют по оптическому стандарту до содержания в 1 мл 500 млн. микробных тел.

В качестве питательной среды при определении бактерицидной активности сыворотки крови используют казеиновую среду, которая готовится из казеинового гидролизата, обогащенного пептоном по такой прописи: казеиновый гидролизат с содержанием в 100 г амминного азота 200 мг, 0,5% пептона, 0,5% Na2HPO4 и 0,3% NaCl. Смесь подщелачивается до pH 7. В.В. Никольский (1968) для этих целей рекомендует бульон Хоттингера.

Ход исследования. В стерильные кюветы с рабочей длиной 10 мм разливают стерильной пипеткой по 4,5 мл питательной среды и добавляют по 0,5 мл испытуемой сыворотки крови (опытные кюветы), затем микропипеткой (или бактериологической петлей диаметром 4 мм) вносят по 0,005 мл. взвеси суточной агаровой культуры кишечной палочки.

В контрольные кюветы вносят те же компоненты, что и в опытные, тольковместо сыворотки крови в них добавляют по 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Содержимое всех кювет тщательно перемешивают платиновой иглой, после чего кюветы закрывают ватно-марлевыми пробками. Затем на фотоэлектроколориметре-нефелометре (ФЭК-М-56) определяют оптическую плотность среды в опытных и контрольных кюветах "сразу". После этого кюветы ставят в термостат при температуре 37┘38°С. Повторное определение оптической плотности содержимого кювет производят через 3, 5, 7, 9, 12, 24 ч. Установку "О" на ФЭКе производят с помощью кюветы, заполненной дистиллированной водой.

Получив по каждой исследуемой сыворотке крови и контролю исходные данные оптической плотности, вычисляют бактерицидную активность сыворотки крови для каждого промежутка времени инкубирования по формуле 4, составленной О.В. Смирновой и Т.А. Кузьминой (1966).

А=100 -(100 Dt - Dc) /D't - D'c (4),

где А - бактерицидная активность, %

Dt - оптическая плотность через 3, 5, 7, 9 ,12, 24 ч;

Dc - оптическая плотность перед постановкой в термостат;

D't - оптическая плотность контроля через 3, 5, 7, 9 ,12, 24 ч;

D'c - оптическая плотность контроляперед постановкой в термостат;

t- время экспозиции кювет в термостате, ч

Однако описанный способ окончательной оцени бактерицидности сыворотки крови не вполне удобен для сравнения получаемых в разных опытах результатов. Поэтому был разработан новый принцип, основанный на исчислении общего эффекта, выражающего в одном цифровом значении как величину бактерицидной активности в процентах, так и длительность ее проявления в часах. Этот феномен был назван напряженностью бактерицидной активности (НАБ).

Вычислив уровень бактерицидности испытуемой сыворотки через исследуемые промежутки времени, определяют среднюю НБА по формуле 5.

_{средняя} НБА=∑А_nT_n/∑T_n= А₁Т₁1+А₂Т₂+А₃Т₃+ ┘+ А_nT_n/ Т₁+Т₂+Т₃+ ┘ +Т_n          (5),

где - средняя НБА - средняя напряженность бактерицидной активности сыворотки крови;

А₁,А₂,А₃, ┘, А_n - бактерицидная активность сыворотки крови через 3, 5, 7, ┘,24 ч, %

Т₁,Т₂,Т₃, ┘, Т_n - продолжительность термостатирования, ч

Комплементарная активность сыворотки крови определяется в научно-производственных условиях чаще всего с помощью колориметрической методики, описанной Г.Ф. Вагнером (1963) /4/.

На каждую пробу сыворотки берется три центрифужные пробирки: две - для постановки параллельных проб, одна - для контроля. В первые две пробирки наливают по 5,9 мл дистиллированной воды, затем добавляют по 0,1 мл исследуемой негемолизированной сыворотки. Первые две пробирки ставят на водяную баню при 37 ┘ 38°С (на 30 мин), третья - инактивируется при 56°С в течение 30 мин.

Одновременно готовят гемолитическую смесь, в которую включают 2,5% взвеси эритроцитов барана и раствора гемолитической сыворотки на физиологическом растворе в 4-кратном титре. Взвесь эритроцитов барана готовят следующим образом. Взятую от барана кровь отмывают физиологическим раствором до полного просветления. После этого определяют процент гемоглобина по Сали и делают расчет, сколько необходимо опытных эритроцитов для получения 2,5%-ной взвеси, которая при полном гемолизе дает 95% гемоглобина.

Пример: Если в опытных эритроцитах было найдено 60% гемоглобина, то для получения 2,5%-ной взвеси с 95% гемоглобина необходимо взять 3,9575 мл (1,583 х 2,5).

Для получения 2,5%-ной взвеси эритроцитов к 3,96 мл отмытых эритроцитов доливают физиологического раствора до объема 100 мл.

В равных количествах в 2,5%-ную взвесь эритроцитов вливают раствор гемолизина и получают гемолитическую смесь, которую прогревают в водяной бане 30 мин. при температуре 37┘38°С. В каждую из трех пробирок доливают по 4 мл (2 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов и 2 мл гемолизина) гемолитической смеси. Все пробирки ставят водяную баню при 37┘38°С на 30 мин и периодически осторожно встряхивают. Пробирки с параллельными пробами и контролем подвергают центрифугированию в течение 13 мин при 157,5 рад/с. После просветления содержимое каждой из пробирок подвергают фотоколориметрированию с зеленым фильтром против воды. Расчет активности комплемента проводят по следующей формуле 6:

% гемолиза = среднее показание экстинции сыворотки/ показание экстинции контроля × 100          (6)

Пример: Средняя экстинция опыта 0,04, контроля - 0,38:

% гемолиза=0,04/0,38 × 100 =0,5%