Лабораторная работа № 12. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИЙ РОЗЕТКООБРАЗОВАНИЯ

Выделенные с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколло-верографина лимфоциты периферической крови крупного рогатого скота и овец разводят раствором Хэнкса до концентрации 10⁷ клеток/мл.

Для получения Е-розеток (спонтанных розеток) с Т-лимфоцитами крупного рогатого скота к 0,1 мл суспензии лимфоцитов добавляют равный объем фетальной телячьей сыворотки и инкубируют 30 мин в холодильнике при температуре 4°С. К смеси лимфоцитов и фетальной сыворотки добавляют 0,1 мл 2%~й взвеси эритроцитов барана, хорошо перемешивают, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин.

Для определения Т-клеток крови овец к 0,1 мл суспензии лимфоцитов добавляют 0,2 мл 1%-й взвеси эритроцитов барана в 14%-м фиколле, хорошо перемешивают и центрифугируют 15 мил при 1000 об/мин.

Для определения В-лимфоцитов используют реакцию ЕАС-розеткообразования. К 0,1мл суспензии лимфоцитов добавляют 0,1 мл 2%-й взвеси эритроцитов быка обработанных комплементом. Смесь хорошо перемешивают, инкубируют при З7°С в течение 15 мин, а затем центрифугируют 5 мин при I000 об/мин. После чего пробирки со смесью клеток помещают в холодильник с температурой 4°C на 12-16 ч.

Часть супернатанта удаляют, а взвесь клеток ресуспендируют (легким покачиванием).

Одну каплю взвеси на предметном стекле смешивают с одной каплей 0,5% трипанового синего и накрывают покрывным стеклом.

Подсчитывают не менее 200 живых клеток (неокрашенных) и определяют процентное содержание розеткообразующих лимфоцитов. За розетку принимают лимфоцит, присоединивший не менее тр╦х эритроцитов /2/.