Лабораторная работа № 14. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА

Содержание белка в сыворотке крови здоровых животных стабильно. Отклонения уровня белка от нормы свидетельствуют о глубоких нарушениях обмена веществ в организме животных. Снижение содержания белка в сыворотке крови (гипопротеинемия) характеризует длительный недостаток, белковое голодание, пложое усвоение протеина из кормов вследствие хронических расстройств желудочно-кишечного тракта, заболеваний печени, дефицита углеводов, макро- и микроэлементов в рационе. Повышение уровня белка в сыворотке крови (гиперпротеинемия) наблюдают при высококонцентратном типе кормления, заболеваниях печени (гепатиты, дистрофия), желудочно-кишечного тракта.

Биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодействии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.

Материалы и оборудование: исследуемая сыворотка, биуретовый реактив основной, раствор едкого натра 0,2 н, раствор йодистого калия 0,5% в растворе едкого натра, физраствор, стандартный раствор альбумина, ФЭК, холодильник, пробирки, пипетка на 0,1, 1 и 5 мл, мерные колбы на 100, 500 и 1000 мл, термостат.

Ход работы: Перед началом определения готовят необходимые реактивы. Биуретовый реактив основной готовят так:4,5 г калия или натрия виннокислого 4-водного растворяют в 40 мл 0,2 н раствора едкого натра. После растворения добавляют 1,5 г сернокислой меди 5-водной и 0,5 г йодистого калия. Перемешивают до полного растворения и доводят до 100 мл в мерной колбе 0,1 н раствором едкого натра. Реактив стоек, его хрянят в посуде из темного стекла.

Раствор едкого натра (0,2 н) готовят внесением 8 г вещества в мерную колбу на 1000 мл и доливают до метки дистиллированную воду. Затем 2,5 г йодистого калия вносят в мерную колбу на 500 мл и доливают до метки 0,2 н раствором едкого натра. Получают 0,5% раствор едкого натра в растворе NaOH, который хранят в посуде из темного стекла не более двух недель.

Рабочий раствор биуретового реактива с четырьмя частями 0,5% раствора йодистого калия в едком натре. Хранят не более двух недель в холодильнике. Стандартный раствор альбумина готовится следующим образом. В пробирку вносят 1 г кристаллического сывороточного или плацентарного альбумина и 9 мл 0,9% хлористого натрия (физраствор). Тщательно перемешивают. Один миллилитр полученного раствора содержит 0,1 г белка. Хранят в холодильнике.

Ход определения: включает следующие этапы. К 0,1 мл исследуемой сыворотки добавляют 5 мл рабочего биуретового реактива и смешивают, избегая образования пены. Через 30 минут (не позднее, чем через час) измеряют экстинкцию на ФЭК в кювете рабочей ширины 10 мм при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контроля, в котором сыворотку заменяют 0,1 мл физраствора. Расчет производят по калибровочному графику (см. табл. 2). Из каждого разведения вносят в пробирки (3-4 повторности) по 0,1 мл раствора альбумина и обрабатывают, как и сыворотку крови. По полученным данным, усредненным по 3-4 измерениям, строят калибровочную кривую.

Если в сыворотке крови содержится более 10% белка, то ее разводят физраствором в соотношении 1:1, а результат умножают на два. В целом ошибка данного метода не превышает 2 %.

Но если у Вас нет времени, но есть деньги, Вы можете воспользоваться набором реагентов для определения содержания белка в сыворотке и плазме крови, выпускаемым различными научно-производственными центрами, и реализуемым через специальную сеть магазинов.