Лабораторная работа № 15. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА МЕМБРАНЕ ИЗ АЦЕТАТЦЕЛЛЮЛОЗЫ
Электрохимические свойства белков.
Все белки обладают электрическим зарядом. Величина заряда определяется количеством ионогенных групп аминокислот, входящих в состав белка. Наличие заряда на белковых молекулах обуславливает их передвижение в электрическом поле постоянного тока. Это свойство белков используют в методе электрофореза для разделения белков биологических жидкостей и тканей.
Метод электрофореза широко применяют в клинике для анализа белков плазмы и сыворотки крови. Концентрация белков плазмы составляет 60 - 80 г/л. Сыворотка крови представляет собой плазму, лишенную фибриногена. При заболеваниях может изменяться как общее количество белков плазмы, так и содержание отдельных белков или белковых фракций без изменения общего количества белка. При некоторых заболеваниях, например при воспалении почек, циррозе печени и др., наблюдается уменьшение содержания белков плазмы (за счет снижения количества альбуминов). Напротив, острые инфекционные заболевания, рост некоторых злокачественных новообразований сопровождаются повышением содержания белков в крови, чаще всего глобулиновой фракции. Поэтому анализ белков сыворотки крови имеет большое диагностическое значение и позволяет наблюдать за ходом лечения.
Принцип метода. Данный метод позволяет определить качественный и количественный состав белков сыворотки крови. Белки сыворотки крови разделяются в электрическом поле на мембранах из ацетатцеллюлозы на пять основных фракций, каждая из которых включает несколько различных белков. Белковые фракции выявляют путем фиксации и окрашивания на мембранах красителем пунцовым "С". Количество белка во фракциях может быть определенно с помощью денситометра.
Ход работы.
Готовят камеру для электрофореза: заполняют ее веронал-мединаловым буфером рН 8,6, прокладывают "фитили" из фильтровальной бумаги до разделяющей пластинки.
На сухой мембране ацетатцеллюлозы помечают карандашом "Старт". Очень медленно кладут мембраны в кювету с буфером таким образом, чтобы она впитывала жидкость только снизу за счет капиллярных сил, так как при быстром погружении в ее порах может остаться воздух. Смоченную мембрану промокают фильтровальной бумагой для снятия излишка буфера.
Влажную мембрану накладывают на рамку в электрофоретическую камеру так, чтобы был контакт с буфером через "фитили" фильтровальной бумаги.
Аппликатор опускают в сосуд с сывороткой, слегка касаясь металлическими рамками поверхности жидкости. Забранную аппликатором сыворотку аккуратно наносят на стартовую линию мембраны (на катодный край).
Сразу после нанесения образцов герметично закрывают крышку камеры и подключают электрический ток от выпрямителя (напряжение 150 В, сила тока 1 мА). Электрофорез проводят в течение 20 мин.
После отключения тока открывают электрофоретическую камеру и переносят мембрану в красящий раствор - пунцовый "С", налитый в кювету.
Через 7 мин краситель сливают из кюветы обратно в склянку, а мембрану промывают 2-7 % раствором уксусной кислоты для удаления избытка красителя (2 раза по 5 мин). На мембране остаются окрашенные полосы белка.
Мембрану просушивают между листами фильтровальной бумаги. Результаты электрофореза сравнивают с образцом электрофореграммы сыворотки крови здорового человека (рис.) /5/.
Рис. Электрофореграмма сыворотки крови белков здорового животного
Физиологические пределы белковых фракций
Определение белковых фракций позволяет провести дифференциацию отдельных видов гипо- и гиперпротеинемии, а также выявить профиль белковых фракций сыворотки крови при ряде заболеваний и состояний, не сопровождающихся изменениями общего содержания белка.
Снижение альбуминов наблюдается при острых воспалительных процессах, поздних стадиях пневмонии, нефрозах и нефритах, токсикозах беременности, злокачественных новообразованиях кроветворного и лимфотического аппарата, при гепатитах, циррозах печени.
Уменьшение альбуминов при одновременном увеличении b-глобулинов и a-глобулинов отмечается при гепатитах. Для цироза характерно снижение альбуминов и резкое увеличение g-глобулинов. Изменение белковых фракций обусловливают диспроинемию, выражением которой является белковый коэффициент (отношение между количеством альбуминов и суммой глобулинов). В норме оно составляет 0,9-1,4.