Лейкоциты способны захватывать, переваривать и полностью нейтрализовать чужеродные вещества и микроорганизмы. Это свойство называется фагоцитозом, и сильнее всего оно выражено у нейтрофилов - амебоидных клеток, мигрирующих в места повреждения клеток и тканей.

Фагоцитарная активность лейкоцитов является важной составляющей частью общей резистентности организма, что определяет диагностическую и прогностическую ценность данного показателя в иммунобиологическом мониторинге сельскохозяйственных животных.

Материалы и оборудование. Исследуемая кровь, термостат, пробирки, предметные и покровные стекла, суспензия кармина или туши, взвесь бактерий, краска Романовского, раствор Рингера, 2% раствор цитрата натрия, этиловый спирт, вата, марля, микроскоп.

Ход работы. В лабораторных условиях определение фагоцитарной активности можно проводить по методу Н.В. Пучкова (1). Для этого в пробирку помещают 0,1 мл раствора цитрата натрия, 0,4 мл свежевзятой крови и 0,1 мл суспензии однородных зернышек кармина (туши) или взвесь микробных тел.

Смесь в пробирке взбалтывают 5 минут и ставят в термостат на 30 минут при 37°С. В течение этого времени через равные промежутки дважды по одной минуте помешивают содержимое пробирки. Затем готовят мазки крови, которые фиксируют 5 минут метиловым спиртом, красят по Романовскому и микроскопируют. На край мазка наносят каплю иммерсионного масла и погружают в нее объектив (х90) под визуальным контролем. При хорошем освещении поля зрения находят 100 лейкоцитов и анализируют в них активность фагоцитоза. Для этого определяют процент лейкоцитов, поглотивших инородные частицы - зернышки краски или микробные клетки, а также фагоцитарное число, то есть среднее количество инородных частиц, поглощенных одним лейкоцитом.

Пример расчета. Пусть в 87 лейкоцитах из 100 обнаружены микробы; следовательно, процент фагоцитоза составит 87%. Пусть внутри этих 87-и лейкоцитов найдено 610 инородных частиц, тогда фагоцитарное число составит 610:87=7,01.

Опсоно-фагоцитарная реакция

Стимулами для миграции нейтрофилов к местам повреждения служат вещества, освобождаемые разрушенными клетками крови и тканей. Нейтрофилы способны распознавать любые бактерии, проникшие в организм. Эту способность усиливают плазменные белки, называемые опсонинами, которые прикрепляются к поверхности бактерий и облегчают их узнавание. На этой способности нейтрофилов и опсонинов основаны методы расчетов интенсивности опсоно-фагоцитарной реакции.

Метод заключается на определении в условиях in vitro способности нейтрофилов периферической крови исследуемых животных (постановкой опсоно-фагоцитарной реакции - ОФР) фагировать (поглощать) микробные клетки. В качестве тест-культуры для ОФР используется чаще всего белый стафилококк - Staph. albus.

До сих пор у исследователей нет единой (унифицированной) терминологии относительно тех явлений фагоцитоза, которые они оценивают, а также и единого мнения о количестве тестов, оценивающих уровень фагоцитоза в организме животных.

О фагоцитарной способности лейкоцитов крови можно судить по данным их фагоцитарной активности, показателям общей фагоцитарной емкости, фагоцитарного числа и индекса, а также показателю завершенного фагоцитоза /2/.

Фагоцитарная активность выражается процентным отношением активных, участвовавших в фагоцитозе лейкоцитов к общему числу подсчитанных нейтрофильных лейкоцитов.

Ход работы: Для определения фагоцитарной активности лейкоцитов берется кровь (из ушных сосудов или при общих анализах из яремной вены) в количестве 0,1 мл, вносится в стерильную пробирку с 0,05 мл 2%-ного раствора лимоннокислого натрия (или гепарина) и осторожно смешивается. После этого в каждую пробирку со стабилизированной кровью вносится убитая при 70°С в течение 30 мин суточная двухмиллиардная культура определенного тест-микроба. В зависимости от цели исследования для постановки опыта могут быть использованы различные виды микроорганизмов. Наиболее часто при изучении состояния естественной резистентности используется культура золотистого или белого стафилококка того или иного штамма (209, 997 и др.).

Пробирку с приготовленной смесью осторожно встряхивают и ставят на 30 мин в водяную баню или термостат при температуре 37┘38°С. Через каждые 10 мин пробирки встряхивают, затем из крови готовят тонкие мазки. Их фиксируют метиловым спиртом и окрашивают методом Романовского-Гимза. При микроскопии мазка подсчитывают число фагоцитировавших лейкоцитов (чаще нейтрофилов, но можно также и других клеток - лимфоцитов, эозинофилов, моноцитов) из общего числа подсчитанных. Для получения достоверных результатов количество последних должно быть не менее 100.

Фагоцитарный индекс определяется средним числом фагоцитированных микробов, приходящихся на один активный лейкоцит. Фагоцитарный индекс характеризует интенсивность фагоцитоза. Для определения фагоцитарного индекса служат те же самые мазки, по которым определялась фагоцитарная активность лейкоцитов. В препаратах, приготовленных описанным выше способом, подсчитывают не менее 100 лейкоцитов и количество поглощенных ими микробных тел. Вычисляется фагоцитарный индекс путем деления числа фагоцитированных бактерий на число активных лейкоцитов.

Пример: При изучении мазка установлено, что из 100 просмотренных лейкоцитов в фагоцитозе приняло участие 80 лейкоцитарных клеток, которые фагоцитировали 400 микробных тел. Следовательно, фагоцитарный индекс равен 5 (400 : 80).

Фагоцитарное число является дополнительным показателем, характеризующим как агрессивность лейкоцитов, так и активность их. Вычисляется фагоцитарное число путем деления числа фагоцитированных бактерий на общее число подсчитанных лейкоцитов.

Пример: При просмотре мазка установлено, что на 100 учтенных лейкоцитов приходится 400 фагоцитированных микробных тел. Тогда фагоцитарное число будет равно 4 (400:100).

Фагоцитарная емкость определяется количеством микробных тел, фагоцитированных лейкоцитами 1 мм³ крови. Этот показатель характеризует общую фагоцитарную активность крови и зависит от количества лейкоцитов, содержащихся в 1 мм³ ее. Некоторые авторы этот показатель называют фагоцитарной интенсивностью, абсолютным фагоцитозом или общим фагоцитозом. Определяется фагоцитарная емкость умножением фагоцитарного числа на количество лейкоцитов в 1 мм³ крови.

Пример: Подсчетом мазков установлена величина фагоцитарного числа 4, а в 1 мм³ крови найдено 7 тыс. лейкоцитов. Следовательно, фагоцитарная емкость будет равна 28 тыс. микробных тел (4 х 7000).

Завершенный фагоцитоз - показатель, определяемый количеством клеток с завершенным фагоцитозом на 100 фагоцитированных сегментоядерных нейтрофилов. Процесс фагоцитоза складывается из ряда последовательных фаз, финалом которых является разрушение микробов в фагоцитах. Однако установить завершенность фагоцитарного процесса трудно в связи с отсутствием достоверных методов оценки физиологического состояния микробов, поглощенных лейкоцитами.

Завершенность фагоцитоза определяется по отсутствию роста микробов внутри лейкоцитов и наличию признаков их разрушения. Техника анализа следующая. В мерную центрифужную пробирку с 5┘10 мг щавелевокислого натрия вносят 0,5┘1 мл исследуемой крови. После тщательного перемешивания в пробирку добавляют равное количество двухмиллиардной взвеси микробов (стафилококка, кишечной палочки и др.). После перемешивания смесь помещают в термостат при 37°С на 30 мин. Затем несколько капель исследуемой лейкоцитарно-микробной взвеси вносят в чашку Петри с застывшим хорошо подсушенным 2%-ным мясо-пептонным агаром и распределяют, как при обычном приготовлении мазков крови.

Засеянные чашки помещают в термоста при 37°С для выращивания микробов и наступления третьей фазы фагоцитарной реакции, т.е. захватывания микробов фагоцитами. Время экспозиции чашек в термостате может варьировать в зависимости от задач опыта и видов микробов. После окончания установленного срока инкубации приступают к изготовлению мазков-отпечатков. Для этого хорошо очищенные и обезжиренные предметные стекла подогревают на пламени горелки и, положив на поверхность агара, слегка прижимают к мазку крови, находящемуся на поверхности агаровой среды. Приготовленные таким образом мазки-отпечатки высушивают, фиксируют 3 мин метиловым спиртом и окрашивают способом Романовского-Гимза.

При микроскопировании препаратов, приготовленных из лейкоцитарно-микробной взвеси, инкубированной в термостате, отчетливо видны различия между жизнеспособными и нежизнеспособными клетками. Первые характеризуются гигантскими размерами, вторые сохраняют исходную величину.

В случаях, когда процесс фагоцитоза носит завершенный характер, внутри лейкоцитов отмечаются фрагменты разрушенных клеток, имеющих разнообразную форму, и отдельные микробные тела значительно меньших размеров, чем в лейкоцитах с незавершенным фагоцитозом.