Для выявления киллерной активности клеток существует ряд методов. Часто для количественной и функциональной оценки клеток-киллеров используют метод бляшкообразования. Ниже приводится метод определения популяции нормальных киллеров аутологических эритроцитов (НКАЭ), играющих важную роль в процессах эритропоэза и адаптогенеза. За основу метода взят метод определения аутобляшкообразующих клеток, предложенный Клемпарской Н.Н. /3/.
Ход работы: Для приготовления препаратов: берут предметные стекла (76× 27 мм) и покровные стекла (24× 24 мм), предварительно тщательно вымытые, обезжиренные и подвергнутые прокаливанию над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд перед работой в условиях боксов. Препараты готовят в камерах, образованных при наложении покровного стекла, смазанного по периметру вазелином, на поверхность предметного стекла. Тщательная обработка стекол способствует лучшему растеканию капель и гомогенности препаратов. Вся посуда, растворы, используемые в работе, должны быть стерильными. Препараты готовят в условиях бокса.
Реактивы: среда 199, цитрат натрия.
Определение НКАЭ в периферической крови. При определении НКАЭ в крови на левую часть предметного стекла наносится цитратная кровь в объеме 0,02 мл и 0,02 мл среды 199, на правую часть 0,02 мл крови и 0,02 мл 5% раствора уксусной кислоты. Смесь аккуратно и тщательно размешивается стеклянной палочкой (капилляр, запаянный с 2-х сторон), накрывается покровным стеклом, смазанным вазелином, и инкубируется 40 мин при комнатной температуре, затем 18-24 часов при 7-10°С и 40-60 мин вновь при комнатной температуре. При такой инкубации не наблюдается артефактов при микроскопировании препаратов. После инкубации препараты представляют гомогенное поле эритроцитов, где отчетливо видны светлые круглые зоны гемолиза - бляшки. В некоторых зонах гемолиза присутствует аутобляшкообразующая клетка либо еще не поврежденная, либо чаще находящаяся в различной стадии лизиса. Чаще клетка полностью разрушена.
Определение НКМЭ в органах. При определении НКАЭ в органах имеет место следующая процедура. На левую часть покровного стекла наносится 0,01 мл цитратной крови, 0,02 среды 199, 0,01 мл клеточной взвеси селезенки, костного мозга или тимуса; на правую часть наносится 0,01 мл клеточной взвеси селезенки, тимуса, костного мозга,0,01 мл среды 199 и 0,02 уксусной кислоты.
Клеточную взвесь получают на холоду как описано выше. Клетки гомогенизируют в гомоненизаторе и 2-3 раза отмывают средой 199. Внесение клеток в препарат должно быть примерно постоянным: 107 кл/мл.
Подсчет количества НКАЭ. Подсчитывают число зон гемолиза в 10 полях зрения на левой части препарата, выбранных следующим образом:
Необходимо добиваться однородности посева лейкоцитов, причем их должно быть не менее 50-70 штук в поле зрения. Посев меньшего числа клеток при небольшом проценте среди них НКАЭ не всегда может обеспечить попадание достаточного их количества в поле зрения, что дает неверное представление о суммарном количества НКАЭ в периферической крови и органах /3/.