Для иммунобиологических исследований большое значение имеет выделение лимфоцитов из цельной крови, основанной на различиях клеток крови в удельном весе, адгезивных и фагоцитарных свойствах форменных элементов крови. В частности, получение лимфоцитарных суспензий используется для внутрикожного введения животным с целью получения антилимфоцитарных сывороток крупного рогатого скота.

Кровь крупного рогатого скота отличается от крови других животных и человека преобладанием лимфоцитов над гранулоцитами и очень низкой скоростью оседания эритроцитов. Кроме того, большое количество тромбоцитов и их одинаковый удельный вес с лимфоцитами затрудняют получение суспензий, содержащих чистые Т- и В-лимфоциты. Тем не менее, эти -клеточные популяции чрезвычайно важны для проведения ряда серологических реакций. Поэтому в настоящее время ведется поиск методических подходов к решению указанной задачи. Ниже приводится методика, разработанная в Московской ветеринарной академии им.К.И.Скрябина (1988).

Согласно этой методике, выделение лимфоцитарных популяций из крови КРС производится в три этапа: выделение лейкоцитарной массы, выделение чистых лимфоцитов и разделение последних на Т- и В-лимфоцитов.

Материалы и оборудование. Исследуемая кровь, стабилизирующий раствор (2% натрий лимоннокислый), гемолизирующий раствор (0,83% хлорид аммония), забуференный физиологический раствор, 9% раствор фиколла, 33,9% раствор верографина, трипановый синий (краситель), центрифуга, микроскоп.

Ход работы. Первый этап: выделение лейкоцитов из цельной крови. Из яремной вены донора в в сосуд со стабилизирующим раствором берут 250 мл крови. Цитратную кровь разливают в центрифужные стаканы и добавляют 0,83%-ный раствор хлористого аммоний в соотношении 1:3. Через 3-5 минут наступает гемолиз. Гемолизат центрифугируют в течение 20 минут при 200 об/мин.

Надосадочную жидкость удаляют, лейкоциты переносят в чистые центрифужные пробирки и, по мере надобности, еще раз проводят гемолиз для удаления остатков эритроцитов.

Чистые лейкоциты отмывают один раз физраствором. Суспензия, содержащаяся в 1,0-1,5 мл 70-100х10⁶ клеток, готова к иммунизации или к дальнейшей работе по выделению лимфоцитов.

Второй этап: выделение лимфоцитов. На разделение клеток в цельной крови (на лимфоциты, тромбоциты, гранулоциты и эритроциты) значительное влияние оказывает удельная плотность раствора фиколл-верографина, время и скорость центрифугирования, а также количество наслаиваемой крови.

Наслаивают 3 мл крови КРС на 2,5 мл раствора фиколл-верографина с плотностью 1,076-1,077 (9% раствор фиколла и 33,9% раствор верографина в соотношении 24:10 соответственно) и центрифугируют строго 40 минут при 400 об/мин. или 15 минут при 1600 об/мин. Обороты в минуту рассчитывают для каждой центрифуги отдельно.

После центрифугирования получают в пробирке следующие фракции: на дне четкий слой эритроцитов, содержащий также и гранулоциты; над ними матовый слой, состоящий из тромбоцитов и частично лимфоцитов; далее четкое белое кольцо, содержащее в основном лимфоциты; самый верхний слой состоит из плазмы крови.

Плазму осторожно отсасывают пипеткой и кольцо лимфоцитов переносят в чистую центрифужную пробирку с забуференным физраствором. Полученные лимфоциты трижды промывают забуференным физраствором или раствором Хенкса, центрифугируя при 100 об/мин. по 7 минут до максимального освобождения от тромбоцитов. Трехкратное центрифугирование удаляет более 95% тромбоцитов. Концентрация клеток, равная 4000 кл/мкл, достаточна для проведения иммунологических реакций.

При выделении лимфоцитов из крови молодняка до 6-месячного возраста, у животных с повышенным лимфоцитозом кровь необходимо разбавлять физраствором до концентрации 7-8 тыс. клеток в 1 мкл. крови.

Третий этап: выделение Т- и В-лимфоцитов. Для проведения этого этапа работы необходимо иметь следующие специальные материалы: чашку Петри ТУ 64-2-19-79 диаметром 40 мм, специфические антисыворотки к иммуноглобулинам в расфасовке 1 мл в ампуле в сухом виде.

Специфические антисыворотки к иммунглобулинам (по одной ампуле каждая) разводят в 50 мл дистиллированной воды. Раствор можно употреблять неоднократно, вплоть до его истощения, хранить в холодильнике.

Чашки Петри заполняют раствором специфических антииммуноглобулиновых сывороток на 1/3 объема. Инкубируют при комнатной температуре в течение одного часа. Затем сыворотку удаляют для последующего использования, а чашки Петри осторожно промывают забуференным физиологическим раствором.

В подготовленные чашки Петри наслаивают ранее полученную суспензию лимфоцитов концентрацией 6х10⁶ кл/мкл и объемом не более ранее внесенной смеси сывороток против иммуноглобулинов, инкубируют при комнатной температуре один час, осторожно покачивая чашки через каждый 15 минут.

В центрифужные пробирки забуференным физраствором осторожно смывают не прилипшие к поверхности чашки клетки - это Т-лимфоциты и нулевый клетки. Смывание продолжают до тех пор, пока не исчезнут "плывущие" клетки, что визуально контролируется под микроскопом.

В-лимфоциты, обладающие поверхностными антигенами к имуноглобулинам и фиксированные таким образом на обработанной поверхности чашек Петри, смывают энергичным пипетированием физиологическим раствором, после чего собирают в центрифужные пробирки. Чистоту снятия фиксированных клеток с поверхности чашек Петри контролируют под микроскопом.

Осадок В-лимфоцитов получают центрифугированием снятых клеток в конических пробирках в течение 7 минут при 100 об/мин. После удаления супернннатанта клетки готовы для дальнейшего использования. Когда поверхностные рецепторы В-лимфоцитов узнают комплементарные им антигены, В-лимфоциты начинают делиться, образуя клоны генетически идентичных плазматических клеток. Последние синтезируют большие количества антител одного вида, вследствие чего могут использоваться в гибридомных технологиях.