Модуль 1. Общая патологическая анатомия животных

Тема 1.1. Основы патогистологической техники

Самостоятельная работа

Самостоятельная работа

Основы патогистологической техники

Введение

Схема патолого–гистологической обработки материала

Подготовка материала к микрокопированию. Окраска срезов

Декальцинация

Уплотнение материала (заключение в парафин, целлоидин)

Изготовление срезов

Окрашивание срезов гематоксилином и эозином

Введение

Патологическая анатомия изучает нарушения нормального строения органов и тканей, возникающие в больном организме. При этом изучению подвергаются изменения, доступные невооруженному глазу, так и более тонкие, т.е. требующие применения микроскопа.

Задачей патолого–гистологической техники является подготовка патологического материала для микроскопического исследования, заключающаяся в обработке материала, позволяющей произвести оптическую дифференцировку элементов органов, ткани, клетки.

а)трупы павших и убитых животных;

б)трупы экспериментальных животных;

в)органы, удаляемые у больных животных при хирургических операциях.

Схема патолого–гистологической
обработки материала

1. Взятие материала.
2. Фиксация материала (формалин, дополнительные фиксаторы).
3. Подготовка к микроскопированию:

   а) декальцинация;

   б) заливка в целлоидин;

   в) заливка в парафин.

4. Изготовление срезов (микротомирование).
5. Окраска срезов:

   а) окраска Гематоксилин-эозином;

   б) дополнительные окраски.

6. Заключение окрашенных срезов под покровное стекло.

Правила взятия материала от трупов для патогистологического исследования:

1. Материал следует брать от свежих трупов не позднее 12 часов после смерти.
2. Материал должен быть взят:

   Фиксацией называется обработка с целью сохранения структуры объектов в неизменном состоянии от воздействия:

   а)от каждого органа, где обнаружены патологические изменения;

   б) от главнейших внутренних органов.

3. От каждого патологически измененного органа нужно брать несколько кусочков из различных участков поражения.
4. В вырезанном кусочке кроме измененного участка должна быть нормальная ткань.
5. Материал должен фиксироваться немедленно и непосредственно после взятия.

Общие сведения о фиксации патологического материала

Фиксацией называется обработка с целью сохранения структуры объектов в неизменном состоянии от воздействия:

а)физических факторов (высыхание);

б)неорганических факторов (окисление);

в)органических факторов (гниение, патолиз).

Сущность фиксации заключается в коллоидной реакции превращения тканевых белков из золя в гель, т.е. в коагуляции белков. Фиксирующая жидкость может быть простой или сложной. Сложными жидкостями называются жидкости, состоящие из нескольких веществ (жидкость Карнуа, Мюллера, Ценкера и др.).

Преимуществом метода фиксации является возможность длительного сохранения материала.

Недостатком метода является некоторое искажение истинной структуры органа. Искажение истинной структуры органа называется артефактом. Артефакт корригируется:

а) наблюдением свежих объектов;

б) использованием различных фиксаторов.

Общие правила фиксации материала

1. Материал фиксируется непосредственно и немедленно после взятия.
2. Для фиксации материала употребляется стеклянная или глиняная посуда (избегать металлической).
3. Объем фиксирующей жидкости должен в 5–10 раз превышать объем фиксируемого материала.
4. Фиксирующая жидкость меняется каждые сутки до тех пор, пока она не станет прозрачной.
5. Материал оформляется этикеткой из плотной бумаги с надписью графитным карандашом или тушью.
6. Фиксирование производится без доступа света.
7. Повышенная температура ускоряет фиксацию. Оптимальная температура фиксации 370С.

Самым распространенным стандартным методом фиксации является формалин. Формалином называется 40%-водный раствор газа формальдегида (НСОН).

Правила фиксации материала в формалине

1. Формалин хранится в темном помещении или темной посуде при температуре не ниже 90С.
2. Продажный формалин нейтрализуется прибавлением сухого мела или углекислой магнезии до 1/10–1/20 его объема.
3. Рабочей фиксирующей жидкостью является 10–20% водный раствор формалина. Нейтрального формалина 10–20см3. Воды водопроводной 90–80см3.
4. Показателем окончания фиксации в формалине является исчезновение кровавой окраски глубоких частей фиксируемого объекта.
5. Метод экстренной фиксации:

   а) кусочек материала толщиной менее 0,5см помещается в пробирку с 20%-водным формалином;

   б) нагревается в течение 3–5мин, до появления пузырьков (не кипятить).

6. Формалиновая фиксация не достигает цели при исследовании:

   а) тонких цитологических структур;

   б) веществ, растворимых в воде (гликоген, мочевая кислота).

Достоинства формалиновой фиксации

1. Простота и дешевизна.
2. Хорошая сохраняемость структур.

Недостатки фиксации в формалине

1. Невозможность выявления веществ, растворимых в воде (гликоген, мочевая кислота).
2. Плохое выявление цитологических структур (хондриосом, аппарата Гольджи и др.).

Для выявления веществ, растворимых в воде, пользуются безводными фиксаторами (абсолютный спирт, 96% спирт).

Сложные фиксирующие жидкости

1. Жидкость Мюллера: Двухромовокислого калия–2,5гр.; Сернокислого натра–1,0гр.; Дистиллированной воды–100,0мл. Продолжительность фиксации–1–6 недель (при Т–370С, 1–2 недели с еженедельной сменой жидкости).
2. Жидкость Ценкера: Жидкость Мюллера–100,0мл.; Сулемы–5,0гр. Уксусная кислота–5,0мл (добавляется перед употреблением). Продолжение фиксации 6–12часов.

Примечание:

1. После окончания фиксации–промывка в воде (24часа).
2. Освобождение от сулемы в 70%-спирте.
3. Зафиксированный материал хранится в 70%-спирте.

Подготовка материала к микрокопированию. Окраска срезов

Декальцинация

Декальцинацией называется удаление извести из материала. Известь является физиологическим компонентом в некоторых тканях (кость) и очень часто является патологическим продуктом (в обызвествленных хрящах, в туберкулезных, сапных, паразитарных узелках). Известь создает препятствия для приготовления срезов и поэтому должны быть удалена. Все методы декальцинации основаны на растворении извести в слабых растворах кислот. Кислоты, в свою очередь, нейтрализуются слабыми щелочными растворами.

Декальцинирующие жидкости:

Азотная кислота–3–10см3.

Воды дистиллированной–97–90см3.

1. Материал помещается в декальцинирующую жидкость, объем которой в 5–10 раз должен превышать объем взятого кусочка.
2. Окончание декальцинации определяется возможностью произвести надрез или прокол иглой всего кусочка.
3. Нейтрализация (24 часа) в одной из следующих жидкостей:

   а) 5%-водный раствор калийных квасцов;

   б) насыщенный раствор углекислого лития.

Уплотнение материала

Заливка материала в плотные среды необходима:

1. Для гомогенизации (однородности) обрабатываемого материала.
2. Для скрепления (цементирования) тканевых элементов материала.

Наиболее употребительными способами уплотнения материала являются:

а) для замораживания–плотной средой служит сухой лед;

б) для заливки в прозрачные среды–целлоидин, парафин, желатин.

Заливка материала в целлоидин

В патогистологической технике употребляется специальный целлоидин, кинолента, коллодиум, который растворяется в спирт эфире.

Схема заливки в целлоидин:

1. Фиксация (различные фиксаторы).
2. Обезвоживание (спирты 2–3суток).
3. Заливка в целлоидин: смесь спирта с эфиром, 6–24часа;

   Целлоидин жидкий 5%, 2–4дня;

   целлоидин густой 10%, 1–2дня;

   уплотнение целлоидина в чашечках, 2–3дня.

4. Наклеивание целлоидиновых блоков на деревянные кубики и хранение в 70%-спирте.

Заключение материала в парафин

Схема заливки в парафин:

1. Фиксация (различные фиксаторы).
2. Обезвоживание: спирт 50%, 1–2суток;

   спирт 70%, 1–2суток;

   спирт 96%, 1–2суток;

   спирт абсолютный, 1–2суток;

   спирт-ксилол, 2–3часа;

   ксилол, 2–3часа.

3. Заключение в парафин:

   ксилол–парафин, 2–3часа;

   парафин, 4–6часов;

   парафин (свежая порция), 4–6часов.

4. Кусочек помещают в бумажную ванночку, заливают растопленным парафином и быстро охлаждают в холодной воде. Блоки хранят в сухом виде.

Изготовление срезов

Объектом патогистологического исследования является срез. Срезы могут быть изготовлены толщиной 1–2мк. Наиболее употребительными являются срезы толщиной в 6–12мк. Аппараты, на которых изготовляют срезы, называются микротомами.

Микротомы бывают:

1. Замораживающий микротом.
2. Санные микротомы.

Основных частей у каждого микротома пять:

Станина.

Держатель ножа.

Предметный столик.

Микрометрическая установка.

Микротомный нож.

Окрашивание срезов

Цель окраски срезов является оптическая дифференцировка структурных элементов и тканей. Сущность окраски выявлена недостаточно. Для объяснения окраски предложено много теорий, которые могут быть подразделены на 3 группы:

1. Физические.
2. Химические.
3. Физико–химические.

Примером химической теории является теория самообразования Эрлиха и Уина, согласно которой при окраске происходит химическое соединение краски и объекта по типу соединения кислот и щелочей с образованием соли.

Примером физической теории окраски является теория адсорбции Ауэрбаха, согласно которой при окраске краситель откладывается на объекте по физическим законам адсорбции без химического соединения.

Примером физико–химической теории является теория обменной адсорбции Михаэльса, согласно которой при окраске происходит коллоидная реакция адсорбции с последующим соединением краски и окрашиваемого вещества по типу адсорбирования. Эта теория в настоящее время является наиболее распространенной.

Употребляемые в гистологической технике краски делятся на 4 группы:

1. Кислые (фоновые) протоплазматические краски. Например, эозин, фуксин кислый, пикриновая кислота.
2. Основные (ядерные). Например, гематоксилин.
3. Нейтральные. Например, метилен–блау, нейтраль–рот.
4. Специальные. Например, Судан-III.

Эозин – кислая краска красного цвета. Реагирует со щелочной протоплазмой.

Гематоксилин – краска со щелочной реакцией лилового цвета. Реагирует с кислым ядром.

Способы окраски:

1. Гематоксилин – эозин – обязательная ориентировочная окраска.
2. Дополнительные методы окраски. Например, на соединительную. ткань, жир, гемосидерин, эластику и т.д.

Окраска срезов гематоксилин – эозином

1. Гематоксилин–5–10мин.
2. Вода водопроводная–до отхождения облачка краски.
3. Эозин водный–0,5–1мин.
4. Вода водопроводная–до отхождения облачка краски.
5. Спирт 50%–1–2мин.
6. Спирт 70%–1–2мин.
7. Спирт 96%–1–2мин.
8. Спирт абсолютный –1–2мин.
9. Карбол–ксилол–до опускания срезов на дно.
10. Ксилол–1–2мин.
11. Натягивание срезов на предметное стекло.
12. Покрыть покровным стеклом, предварительно заключив в бальзам.
13. Просмотр препарата под микроскопом.

Результаты окраски

Ядра клеток синие, с включением хроматинового вещества (темно–синие точки). Цитоплазма розового цвета. Соединительная ткань ярко–розового цвета.